摘要:肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)和汉坦病毒肺综合征(Hantirus pulmonary syndrome, HPS)均是由汉坦病毒属病毒(hantiruses)引起的自然疫源性疾病,目前全世界每年仍有5~10万HFRS和HPS病例发生,病死率因感染的病毒型别而异,自0.1%~40%不等[1-3]。我国是当今世界上受HFRS危害最为严重的国家之一,自建国后至2010年年末,已累计发现上报出血热病例近160万,占到同期世界上总发病例数的83%以上[4]。由于HFRS多散在发生,且早期主要在农村和城镇周边中小医院救治,难以组织开展较大样本、随机、双盲和对照的临床探讨,对各种治疗药物和治疗案例的评价仍缺乏高质量的循证医学的证据,远远落后于乙型和丙型病毒性肝炎等高发传染病。目前临床上抗汉坦病毒感染的治疗药物仍限于利巴韦林和干扰素α等少数品种。且时至今日,美国FDA仍未批准包括利巴韦林等在内的任何针对HFRS和HPS的特效治疗药物[5]。由此,深入探讨汉坦病毒致病的分子机理,进而寻找有效的治疗靶点和抗病物仍是HFRS防治的重要任务。抗微生物肽是近些年发现的新型活性生物分子。短肽或寡肽类分子具有分子量小、抗原性弱、活性强、穿透力强、易于制备且比较容易与靶分子结合等优点,是当前治疗肿瘤和感染等疾病的有效靶向药剂。功能性多肽的筛选工作量十分浩大,需要高通量的筛选技术,而噬菌体展示技术恰好可满足该项工作的需要[6-8]。已知病毒感染靶细胞的第一步是病毒进入(entry)细胞质内,通常需要病毒吸附蛋白或表位与靶细胞的特定受体结合[9]。近年探讨表明β3整合素是汉坦病毒感染靶细胞的关键受体,并且可能参与了血管屏障功能的维持,封闭或阻断β3整合素已成为抗汉坦病毒治疗探讨的重要对策之一[10-11]。本探讨在既往对β3整合素和汉坦病毒感染的基础上,运用噬菌体展示技术,以β3整合素为靶分子,对噬菌体七肽展示库进行8轮亲和筛选,获得结合β3整合素的噬菌体蓝色克隆,挑取其中结合力比较强的克隆,测得插入其中的外源性DNA序列,并推导出各自对应的多肽序列,然后运用生物信息学软件浅析多肽序列的特性,同时行同源性浅析,以而找出特异性结合且与比对序列有相似生物学特性、较高同源性的多肽序列。继之请生物公司合成这些多肽序列,用病毒感染阻断实验对这些多肽的抗汉坦病毒的活性进行初步测试,为进一步设计和获取高活性的抗汉坦病毒短肽奠定了基础。本课题探讨内容和结果如下:1.细菌生长的测定用标有不同时间的锥形瓶和摇菌管分别培育大肠埃希菌E.copER2738,以用于噬菌体的扩增,培养相应的时间后用分光光度计测定600nm波长的OD值,最终找出最佳摇菌时间。结果发现扩增噬菌体时,最佳摇菌时间为2.5h;测滴度时,最佳摇菌时间为5.5h。2.噬菌体肽库的淘筛运用亲和富集法对噬菌体7肽库进行8轮筛选,β3整合素用量逐轮减少,并逐轮缩短结合时间,逐轮延长洗涤时间和不断增加洗涤液中Tween-20的浓度,以筛选得到高亲和力、特异性强的噬菌体克隆。结果显示每轮淘洗噬菌体数量都有较高的富集,淘筛历程中通过用不同梯度浓度的β3整合素靶分子来转变选择强度,在经过8轮淘筛后,我们筛选出与β3整合素具有较高亲和力和较高活性的短肽。3.融合基因的测序和序列浅析比对随机挑取80个克隆,经过DNA测序,得到5条重复率较高结构不同的寡肽序列,分别为TKGPG、LPLTPLP、KLTSSPT、SPVGPLP和DHRNHLV。将上面陈述的多肽序列与汉滩型病毒囊膜糖蛋白氨基酸序列比对,发现5条短肽与汉滩病毒的囊膜糖蛋白具有较高的同源性。运用生物信息学手段浅析这些短肽,发现他们具有与同源序列相似的等电点和典型的疏水性。结论:通过对噬菌体展示肽库的淘筛,获得若干与β3整合素结合并具有潜在抗汉滩病毒的多肽,为进一步设计和获取高活性的抗汉坦病毒短肽奠定了基础。关键词:汉坦病毒论文噬菌体展示论文多肽论文β3整合素论文抗病毒论文
缩略语表5-8
中文摘要8-11
Abstract11-14
前言14-16
文献回顾16-24
一、汉坦病毒致病的多样性及其治疗近况16-19
二、噬菌体展示技术在汉坦病毒探讨中的运用19-24
实验一 利用噬菌体展示技术筛选与汉坦病毒β3 整合素结合的高亲和力肽24-39
一、实验材料24-29
二、实验策略29-34
三、结果34-36
四、讨论36-39
实验二 噬菌体DNA 的序列测定及生物信息学浅析39-54
一、实验材料39-40
二、实验策略40-43
三、结果43-50
四、讨论50-54
小结54-55