摘要：血吸虫病是由血吸虫感染引起的,是一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病。长期以来对于血吸虫病的防治主要采取药物治疗(毗喹酮)的策略,但是长期反复的用药容易引起血吸虫的耐药性,由此研制新的抗血吸虫病的治疗药物是当前的首要任务。若使血吸虫病新药的探讨取得突破性的进展,探讨者们需充分了解血吸虫生长发育的历程及其相关的调控机制。由Wnt蛋白、Frizzled家族受体蛋白及其相关的上下游信号分子构成的Wnnt信号通路,是细胞发育和生长调节的关键途径,对动物的生长发育起着重要的调节作用。本课题组已经成功的获得了日本血吸虫信号转导蛋白SjWnt4和SjWnt2,以及3个Wnt受体蛋白Frizzled的基因以及其它一些相关分子,并对其进行了表达及生物学功能的探讨,初步确定在日本血吸虫体内也有着Wnt信号通路。但是对于Wnt信号通路在血吸虫生长发育中的功能及分子机制需有待进一步阐明。本探讨的策略如下：将日本血吸虫与曼氏血吸虫已知的Wnt和Frizzled序列进行同源性比对,选择保守性好的氨基酸序列进行设计引物,利用touch-up PCR策略扩增日本血吸虫Wnt信号通路受配体编码基因的EST,再利用RACE技术、电子拼接等策略获得全长序列；利用jenomeWalkerTM Universal Kit浅析日本血吸虫Wnt2的基因结构。利用基因克隆技术构建SjWnt2-(60aa-368aa)基因的原核表达载体,并进行SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白的表达、纯化及免疫原性浅析,制备SjWnt2-(60aa-368aa)的小鼠多抗血清,ELISA技术测定抗体效价,Western blot策略鉴定血清的特异性；利用免疫组化(IHC)策略检测SjWnt2-(60aa-368aa)和SjFz5蛋白在不同期别虫体的组织定位。主要探讨结果：(1)获得日本血吸虫Wnt信号通路新基因4个,其中3个(Sjwnt5a、Sjwnt1、 Sjwnt11)为Wnt家族相关基因,1个(Frizzled8)为Frizzled受体基因；对已获得的Wnt2基因结构浅析发现其含有4个内含子,其中内含子1、3、4由于序列比较长未完全测通,内含子2大小为653bp。(2)成功构建SjWnt2-(60aa-368aa)基因的原核表达质粒,运用大肠杆菌系统进行了表达,Western blotting显示表产物能被日本血吸虫虫卵抗原免疫兔血清所识别,具有良好的抗原性。将表达、纯化后的抗原免疫小鼠,制备SjWnt2-(60aa-368aa)卜鼠多抗血清,Western blotting显示SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白的抗血清能与虫体天然蛋白中的单一蛋白条带发生反应。免疫组化(IHC)结果显示SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白主要分布在血吸虫童虫和成虫的吸盘及体壁肌层细胞膜上,而且在雌雄虫的也有显著定位。(3)免疫组化(IHC)结果显示SjFz5蛋白呈现广泛分布,在虫体的口吸盘、腹吸盘、体壁肌细胞层等都有阳性着色。另外,在雌虫卵细胞、卵黄细胞以及雄虫的精细胞上都可见显著的阳性反应。总之,本论文成功获得了与Wnt信号通路相关的可能配体SjwntSa、Sjwntl、Sjwntll及可能的受体Frizzled8基因,为进一步探讨日本血吸虫Wnt信号通路受配体相互作用提供了实验材料。并对已有的SjWnt2和SjFz5进行了免疫组化定位浅析,结果我们发现,SjWnt2和SjFz5蛋白均在血吸虫雌雄虫的上有显著的定位。初步推测SjWnt2和SjFz5可能参与调节生殖细胞的发育,本探讨为深入的探讨Wnt信号通路在日本血吸虫生长发育中的作用,寻找发育调控中的关键信号分子,积极发现新的药靶奠定了基础。关键词：日本血吸虫论文Wnt信号通路论文Wnt2论文Frizzled5论文克隆论文表达论文组织定位论文
摘要8-10
Abstract10-12
1 引言12-20
1.1 本探讨的目的及作用12
1.2 血吸虫生物学12-15
1.2.1 血吸虫及血吸虫病12
1.2.2 血吸虫生活史12-13
1.2.3 血吸虫的致病机理13-14
1.2.4 抗血吸虫药物的探讨进展14-15
1.3 Wnt信号通路及在生长发育中的作用15-18
1.3.1 Wnt信号通路的发现15
1.3.2 Wnt信号转导蛋白15-16
1.3.3 Wnt蛋白受体16-17
1.3.4 Wnt/β-catenin信号通路的级联传递17
1.3.5 Wnt信号通路在生长发育中的作用17-18
1.3.6 Wnt信号通路的探讨前景18
1.4 本探讨的主要内容18
1.5 本探讨的技术路线18-20
2 材料与策略20-33
2.1 日本血吸虫Wnt信号通受配体编码基因的克隆20-23
2.1.1 实验材料20
2.1.2 实验策略20-23
2.2 日本血吸虫Wnt2基因结构的浅析23-27
2.2.1 实验材料23
2.2.2 实验策略23-27
2.3 日本血吸虫Wnt2蛋白的克隆表达及不同发育阶段的组织定位浅析27-31
2.3.1 实验材料27
2.3.2 实验策略27-31
2.4 日本血吸虫Wnt受体蛋白SjFz5在不同发育阶段的组织定位浅析31-33
2.4.1 实验材料31-32
2.4.2 实验策略32-33
3 结果33-54
3.1 日本血吸虫Wnt信号通路受配体编码基因的克隆33-46
3.1.1 日本血吸虫Wnt信号通路受配体编码基因的获得33-35
3.1.2 生物信息学浅析35-46
3.2 日本血吸虫Wnt2基因结构的浅析46-47
3.3 日本血吸虫Wnt2蛋白的克隆表达及不同发育阶段的组织定位浅析47-50
3.3.1 pET28a-SjWnt2-(60aa-368aa)原核表达质粒的构建47-48
3.3.2 重组蛋白的表达、纯化及免疫原性浅析48-49
3.3.3 SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白多克隆抗体的特异性浅析49
3.3.4 SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白在虫体不同发育阶段的组织定位49-50
3.4 日本血吸虫Wnt受体蛋白SjFZ5在不同发育阶段的组织定位浅析50-54
3.4.1 日本血吸虫SjFz5蛋白在虫体不同发育阶段的组织定位50-54
4 讨论54-57
4.1 日本血吸虫Wnt信号通路受配体编码基因的克隆54
4.2 日本血吸虫Wnt2基因结构的浅析54-55
4.3 日本血吸虫Wnt2蛋白的克隆表达及在不同发育阶段的组织定位浅析55
4.4 日本血吸虫Wnt受体蛋白SjFZ5在不同发育阶段的组织定位浅析55-57
5 结论57-58
致谢58-59
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