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摘要：背景乙型肝炎病毒(HBV)在慢性乙型肝炎(CHB)患者体内持续复制,可以引起肝脏炎症和纤维化,严重者可进展为肝硬化甚至肝癌,已成为严重的社会和公共卫生不足。抗病毒治疗是慢性乙型肝炎治疗的关键已成共识。核苷(酸)类似物成为继干扰素α(IFN-α)之后的又一类用于抗乙型肝炎病毒的有效治疗药物。但大多数接受核苷(酸)类似物治疗的患者难以通过短期的治疗来实现持久性应答,故常需要接受长期治疗,这就进一步增加了病毒耐药的风险,并且随着核苷(酸)类似物种类的不断增加,HBV耐药变异的复杂性也逐渐增加。由此,如何有效清除HBV或持续长期抑制HBV的复制,减少病毒耐药的发生,是目前抗病毒治疗工作的重点和难点。随着人们对病毒复制与宿主细胞分子之间联系认识的逐渐加深,最近专家提出一种以宿主细胞为靶位的新的抗病毒对策——通过调节病毒复制各个阶段所依赖的相关宿主细胞蛋白,以而达到抑制病毒复制、减少病毒耐药的目的。有探讨发现亲环素A的抑制剂可以有效干扰病毒RNA的复制,这一发现并被用于指导丙型肝炎病毒(HCV)抗病毒治疗的探讨。细胞内蛋白质的降解是生物体内十分重要的历程,主要包括溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径。溶酶体途径是一个非选择性的降解蛋白质的历程,发生在溶酶体内；泛素-蛋白酶体途径是一个选择性的降解蛋白质的历程,通过选择性的降解细胞内的蛋白质,以而制约着体内许多重要的生物学历程。大量的探讨表明病毒可以通过利用宿主细胞的泛素-蛋白酶体途径逃避开疫系统的监控、推动病毒的复制以及病毒粒子的组装与释放。有探讨报道蛋白酶体抑制剂硼替佐米在HBV转基因小鼠体内可以有效的抑制HBV-DNA的复制,但对HBsAg的抑制作用不显著；而本实验室之前探讨工作亦发现硼替佐米在HBV转基因小鼠原代肝细胞水平不但可以抑制HBV-DNA的复制,而且可以有效抑制HBsAg的表达。由此,蛋白酶体抑制剂的抑制作用是否具有普遍性的作用需要做进一步的探讨加以证实。一直以来,用于评价某种药物对HBV作用效果较为公认的理想细胞模型是HepG2.2.15细胞,但由于HepG2.2.15细胞来源于肝癌细胞系,而蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体的生物学活性,可以诱导肿瘤细胞的凋亡。因本实验探讨药物的特殊性,HepG2.2.15细胞无法作为本实验探讨的理想细胞模型。我们实验室在本中心自行建立的HBV转基因小鼠基础上通过新改良的两步灌流法分离出HBV转基因小鼠原代肝细胞。经长时间的观察发现经此策略分离培养的HBV转基因小鼠原代肝细胞活细胞比例高、细胞活力好,培养24小时后,贴壁的原代肝细胞基本恢复了由于胶原酶消化对细胞膜造成的部分损害,并且在培养的前5天,细胞具有良好的合成白蛋白的能力,并可以稳定的表达HBsAg和HBV-DNA。由此,本探讨采取新分离的HBV转基因小鼠原代肝细胞作为实验探讨的细胞模型。评价具有蛋白酶体抑制剂活性的天然药物——雷公藤红素对转基因小鼠HBV的抑制作用。目的利用本中心自行构建的HBV转基因小鼠,采取新改良的两步灌流法分离HBV转基因小鼠原代肝细胞,在原代肝细胞水平评价雷公藤红素对转基因小鼠原代肝细胞HBV的抑制作用。策略1)采取新改良的两步灌流法分离的HBV转基因小鼠原代肝细胞,培养24h后,用浓度分别为20μmol-L-1、4pmol·L-1、0.8μmol-L-1、0.16μmol-L-1、0.032μmol·L-1、0.0064μmol·L-1、0.00128μmol·L-1、0.000256pmol-L-1的雷公藤红素作用于HBV转基因小鼠原代肝细胞,24h后取培养上清,常规MTT法检测不同浓度的雷公藤红素对转基因小鼠原代肝细胞的细胞毒性作用。2)新分离的HBV转基因小鼠原代肝细胞培养24h后,取最大无毒浓度以下的雷公藤红素,浓度分别设定为0.8μmol-L-1、0.08μmol·L-1、0.008μamol·L-1、0.0008μmol·L-1,作用24小时后取培养上清,分别运用ELISA法和荧光定量PCR法测定HBsAg和HBV-DNA的水平。结果1)雷公藤红素对原代肝细胞TC50为6.490±0.802μmol·L-1；当浓度低于0.8μmol-L-1时对转基因小鼠原代肝细胞没有显著毒性;2)在0.08μmol·L-1和0.8μmol-L-1雷公藤红素组对HBsAg有显著性抑制作用(P=0.000,P=0.000)；0.08μmol-L-1和0.8μmol·L-1雷公藤红素组对HBV-DNA亦具有显著性抑制作用(P=0.009,P=0.044)；随着雷公藤红素浓度的增加,对HBsAg和HBV-DNA的抑制作用逐渐增强。结论具有蛋白酶体抑制剂活性的天然化合物——雷公藤红素不仅可以抑制HBV-DNA的复制,而且可以有效抑制HBsAg的表达。推测雷公藤红素的抑制作用可能与雷公藤红素对蛋白酶体的调节作用有关。蛋白酶体抑制剂抑制了蛋白酶体的活性,使细胞中错误折叠的蛋白质的降解受阻,干扰了细胞的各种新陈代谢历程,这种干扰效果累加起来导致这些细胞优先进入程序性的细胞死亡。第二部分EGCG联合硼替佐米对转基因小鼠原代肝细胞HBV的协同抑制作用背景热休克蛋白(Hsp)是一类ATP依赖的分子伴侣,在维持蛋白质功能的完整性、稳定新生蛋白质并辅助其他蛋白正确的折叠、组装、转运或降解等方面起到十分重要的作用。有探讨证实热休克蛋白60、热休克蛋白70和热休克蛋白90在乙型肝炎病毒复制和组装等生命历程中扮演了重要的角色。EGCG[(-) epigallocatechin-3-gallate,又称表没食子儿茶素没食子酸酯]是绿茶中的主要成分,不仅是一种蛋白酶体抑制剂,而且可以抑制Hsp90的表达。较早的探讨证实,EGCG不但具有显著的清除体内氧自由基、抗肿瘤、抗炎等多种生物学活性,而且在细胞和动物模型上均证实EGCG可以有效的抑制HBV复制,并可以降低血清中转氨酶、减轻肝脏的病理损伤。EGCG作为一种Hsp90的抑制剂,通过干扰病毒复制的后期历程,如结构蛋白的组装、出芽、蛋白的水解成熟以及传染性子代病毒的释放,以而调控、干扰或阻碍病毒蛋白的折叠,以此来干扰病毒多聚蛋白前体蛋白的蛋白水解历程,影响病毒蛋白酶的活性。通常情况下,这些缺乏折叠或未成熟的蛋白质会被泛素-蛋白酶系统统选择性的降解,以而将其以细胞代谢中除去。但当加入蛋白酶体抑制剂之后,抑制了泛素-蛋白酶系统统的生物学活性,使这些缺乏折叠的蛋白质在细胞中积累,由此触发了各种对细胞新陈代谢的影响和干扰。当所有这些干扰效果叠加起来将导致有不足的细胞优先进入程序性的细胞死亡。目的以HBV转基因小鼠原代肝细胞为细胞模型,探讨EGCG单独作用时对HBV的抑制作用及机制。并同时探讨了EGCG联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米对转基因小鼠原代肝细胞HBV的协同抑制作用。策略1)采取新改良的两步灌流法分离HBV转基因小鼠原代肝细胞,用percoll密度梯度离心法纯化原代肝细胞,台盼蓝染色计数,调整细胞密度为8×104·L-1,100μL/孔,铺于明胶包被的96孔板,进行原代培养24小时,加入不同浓度的EGCG,常规MTT法检测不同浓度的EGCG对HBV转基因小鼠原代肝细胞的细胞毒性；2)新分离的HBV转基因小鼠原代肝细胞铺于明胶包被的96孔板,原代培养24h,待细胞贴壁后,加入不同浓度的EGCG联合1μmol·L-1硼替佐米,常规MTT法检测不同浓度的EGCG联合1μmol·L-1硼替佐米对HBV转基因小鼠原代肝细胞的细胞毒性。3)新分离的HBV转基因小鼠原代肝细胞铺于明胶包被的96孔板,设5个平行组,分别为：空白对照组、DMSO组、1μmol·L-1硼替佐米阳性药物对照组、不同浓度(最大无毒浓度以下)的EGCG单药组、不同浓度(最大无毒浓度以下)的EGCG联合1μmol·L-1硼替佐米联合组,作用24小时后取培养上清,分别采取ELISA法和荧光定量PCR法测定HBsAg和HBV-DNA的水平。4)新分离的HBV转基因小鼠原代肝细胞铺于6孔板,分别加入不同浓度的并对HBV具有抑制作用浓度的EGCG,于不同时间下提取细胞蛋白,采取VWestern blot法检测不同浓度EGCG、不同时间作用下HBV转基因小鼠原代肝细胞Hsp90的表达水平。结果1)250μmol-L-1及以下浓度的EGCG对转基因小鼠原代肝细胞均无毒性作用；250μtmol·L-1及以下浓度EGCG联合1μmol·L-1硼替佐米对细胞亦无显著毒性作用；2)当50μmol·L-1和2501μmol·L1EGCG组单独作用时,分别与对照组相比对HBsAg有显著性的抑制作用(P=0.007,P=0.000)；50μmol·L-1和250μmol-L-1EGCG组单独作用时,分别与对照组比对HBV-DNA的抑制作用亦具有显著性(P=0.019,P=0.008)；3)50μmol·L-’的EGCG联合1μmol·L-1硼替佐米时,与EGCG单药组和硼替佐米单药组相比,对HBsAg抑制作用显著均强于EGCG或者硼替佐米单药作用(P=0.000,P=0.002)；250μmol·L-’的EGCG联合1μmol·L-1硼替佐米时,与EGCG单药组和硼替佐米单药组相比,对HBV-DNA的抑制作用显著强于EGCG或者硼替佐米单药作用(P=0.034,P=0.020)；4) Western blot结果显示：EGCG可以抑制HBV转基因小鼠原代肝细胞Hsp90的表达,并且抑制作用随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强。结论EGCG单独作用时不但可以抑制转基因小鼠原代肝细胞HBV-DNA的复制,而且可以有效抑制HBsAg的表达,并推测这种抑制作用可能与Hsp90的表达受到抑制有关。当不同浓度的EGCG与1μmol·L-1硼替佐米联合作用时对HBV体现出显著的协同抑制作用。关键词：乙型肝炎病毒论文雷公藤红素论文蛋白酶体抑制剂论文转基因小鼠原代肝细胞论文HBV-DNA论文EGCG论文硼替佐米论文乙型肝炎病毒论文热休克蛋白90论文转基因小鼠原代肝细胞论文协同抑制作用论文
摘要3-9
ABSTRACT9-17
第1章 雷公藤红素对转基因小鼠原代肝细胞HBV的 #1抑制作用17-32
1.1 前言17-18
1.2 材料和策略18-22
1.3 结果22-27
1.4 讨论27-29
1.5 小结29
1.6 展望29-30
1.7 参考文献30-32
第2章 EGCG联合硼替佐米对转基因小鼠原代肝细胞HBV的协同抑制作用32-50
2.1 前言32-33
2.2 材料和策略33-38
2.3 结果38-45
2.4 讨论45-46
2.5 小结46-47
2.6 展望47
2.7 参考文献47-50
成果50-51
致谢51-53
统计学合格证明53