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摘要：药物成瘾是一种慢性、复发性脑疾病,体现为不计任何负面后果的、强制性的、无法自控的药物利用行为。越来越多的探讨表明,长期滥用成瘾性药物导致奖赏相关脑区基因表达的异常,是成瘾行为形成及维持的重要的分子机制之一。由此,阐明基因表达的调控在药物成瘾行为中的作用及其机制尤为重要。微小RNA (miRNA)是一种短序列的非编码单链小分子RNA,被认为是参与基因转录后水平调控的重要因子之一。它通过其2-8个碱基的种子区识别并结合到下游靶基因mRNA的3’非翻译区(UTR),并招募Dicer和AGO等蛋白形成沉默复合物(RISC),进而发挥抑制或降解靶基因mRNA的作用。近年来,很多体外以及体内的探讨揭示了miRNA在神经系统中的重要功能。但是miRNA在药物成瘾中的作用及作用机制,尚不清楚。表观遗传学修饰是对基因转录进行调控的重要方式之一,主要是通过基因启动子区域染色体的重构来发挥调节基因转录的作用。一般来讲,基因启动子区域组蛋白H3或H4的乙酰化能激活基因的转录。近年来,人们逐步发现了组蛋白乙酰化也在药物成瘾中发挥作用。但作为对基因转录水平调控的一种重要方式,组蛋白乙酰化如何参与对成瘾动机的调控尚未阐明。本探讨采取大鼠条件位置偏爱模型(CPP, Conditioned Place Preference)和自身给药模型(SA, Self-administration)探讨了药物成瘾大鼠伏隔核中miRNA对奖赏行为的影响和组蛋白乙酰化在可卡因觅药动机中的作用机制,取得了以下主要探讨结果：1.长期给药诱导的大鼠伏隔核miR-218下调及其对奖赏行为的调控长期给药调控伏隔核中多种miRNA水平。在给予大鼠(1mg/kg,天2次,连续2周)后,我们采取real-time PCR的策略检测了伏隔核中76种miRNA的前体水平,发现与生理盐水对照组相比,miR-218, miR-221, miR-382, miR-383和miR-351前体的水平显著下调,而miR-21, miR-103, miR-20a和miR-298则显著上调。长期给药下调伏隔核中miR-218成熟体的水平。我们采取real-time PCR的策略检测了长期给药后miR-218成熟体水平,发现与miR-218前体一样,其成熟体在伏隔核中也显著下调,而在海马中没有显著变化。另外,miR-218在前额叶皮层显示出显著下降走势,但无统计学差别。伏隔核中miR-218对大鼠CPP和自给药行为的负性调控。为了探讨伏隔核中miR-218对奖赏行为的影响,我们用慢病毒定位注射的策略干预伏隔核中内源miR-218的表达,然后检测其对CPP和自给药的影响。我们发现用重组慢病毒在大鼠伏隔核中过表达miR-218能显著降低诱导的CPP；相反,在伏隔核中用重组慢病毒表达抑制miR-218活性的RN段能显著增加CPP行为。同时,在伏隔核中过表达miR-218后,大鼠自身给药的踏板行为显著减少,而抑制miR-218后,大鼠的踏板行为显著增加。这些结果提示,伏隔核中miR-218能负性调节奖赏行为。伏隔核中miR-218水平转变不影响大鼠蔗糖自给药和八臂迷宫行为。为了检测伏隔核中miR-218水平变化是否影响自然奖赏和空间学习记忆,我们进行了蔗糖自给药和八臂迷宫实验。在蔗糖自给药实验中,注射了过表达或抑制miR-218病毒的大鼠与对照大鼠相比,摄取蔗糖丸的数量没有差别。在八臂迷宫实验中,也没有观察到注射过表达或是抑制miR-218病毒的大鼠与对照大鼠在完成任务的时间上有着差别。2.筛选miR-218的下游靶基因筛选miR-218调控的基因。我们用Affymetrix大鼠基因芯片筛选了在原代培养的大鼠神经元中转染miR-218后转录水平发生变化的基因。结果显示,在29993个基因序列中,我们检测到了20020个基因在原代培养的神经元中有表达。与对照组相比,有1990个基因的mRNA水平下调,有753个基因的mRNA水平发生上调。运用DID软件进行浅析,显示miR-218调节的mRNA中,有很多与神经突触可塑性相关。采取Targetscan浅析预测表明,在上面陈述的受miR-218调控的基因中MeCP2, DNMT3a(表观遗传学信号通路关键酶),GluR2, GABRB3(重要离子通道蛋白)和Sema6b, NRXN1(调控轴突导)是miR-218的可能靶基因。采取Real-time PCR的实验结果显示,在原代神经元中miR-218可以下调这些候选基因的mRNA水平。GluR2和GABRB3是miR-218的靶基因。在上面陈述的miR-218的靶基因中,GluR2和GABRB3分别编码重要离子通道型受体AMPA和GABA的重要亚基,参与神经可塑性的调节。为了进一步确认GluR2和GABRB3是否为miR-218的靶基因,我们分别运用体外荧光素酶报告基因实验和体内慢病毒定位注射实验检测miR-218是否可以识别这两个基因的3’UTR并调控其表达。在体外实验中,我们观察到miR-218能下调接有GluR2和GABRB33'UTR的荧光素酶的表达,并证明如果在GluR2和GABRB3的3’UTR区的miR-218结合位点引入突变,这种调控作用消失。此外,我们还进一步证明用慢病毒在伏隔核中过表达miR-218能减少该脑区GluR2和GABRB3的蛋白水平,而抑制miR-218则能升高GluR2和GABRB3的蛋白水平。这些结果都提示GluR2和GABRB3是miR-218的靶基因。伏隔核中GluR2水平与CPP评分正相关。我们观察了miR-218的靶基因GluR2和GABRB3的(?)mRNA水平在给药后的变化,发现与生理盐水对照组和一次给药组相比,长期给药能上调伏隔核GluR2和GABRB3基因的mRNA水平,而这种上调并没有在海马脑区中观察到。对GluR2和GABRB3的(?)mRNA水平和CPP评分的相关性浅析表明,伏隔核中的GluR2mRNA水平和CPP评分正相关,而海马脑区中的GluR2mRNA水平与CPP评分无相关性。而GABRB3在伏隔核和海马脑区的mRNA水平与CPP评分相关性均不显著。3.可卡因长期给药诱导的伏隔核组蛋白乙酰化升高和(GaMKIIa转录激活参与觅药动机的调控可卡因长期给药上调伏隔核的成瘾相关基因启动子区组蛋白H3乙酰化水平。我们实验室其他同学的探讨结果表明可卡因长期用药能够上调伏隔核壳部组蛋白H3的乙酰化,并且组蛋白乙酰化参与了对可卡因觅药动机的调节。为了进一步探讨可卡因长期给药导致的组蛋白乙酰化对基因表达的调控,我们用染色质免疫共沉淀技术检测了可卡因长期自给药后大鼠伏隔核脑区15个成瘾相关基因的启动子区组蛋白H3乙酰化水平,发现可卡因长期的利用能够上调伏隔核中CaMKIIa、Cbp、BDNF-P2、BDNF-P3、FosB、 Cdk5、GluR2、NR2A、NR2B和Psd95的启动子区组蛋白H3的乙酰化水平,而这种变化在伏隔核壳部增加更为显著,而核部的升高幅度不如壳部。我们在可卡因长期自身给药大鼠与生理盐水对照大鼠的伏隔核脑区的核部和壳部分别定位注射了HDAC (Histone Deacetylase)抑制剂TSA或过表达HDA的重组腺病毒,并检测这些些成瘾相关基因的启动子区域组蛋白乙酰化水平。我们发现HDAC的抑制剂TSA可以上调可卡因长期给药后大鼠伏隔核中这些基因启动子区组蛋白H3的乙酰化水平,过表达HDA则会下调这些基因启动子区组蛋白H3的乙酰化水平,而这两种处理对长期生理盐水给药组大鼠伏隔核中这些基因启动子区组蛋白H3的乙酰化水平没有影响。这些实验结果提示可卡因长期给药可以诱导伏隔核成瘾相关基因启动子区组蛋白H3乙酰化升高和转录激活,可能参与成瘾奖赏。下调伏隔核脑区壳部中CaMKIIα的表达能降低可卡因觅药动机。我们发现在可卡因长期自给药后,大鼠伏隔核壳部CaMKIIα的mRNA水平升高,并与可卡因的觅药动机正相关,而CaMKIIβ则无升高,与可卡因的觅药动机也不相关。在大鼠伏隔核的壳部显微注射CaMKIIα shRNA后,我们检测了这些大鼠的可卡因觅药动机,发现伏隔核脑区壳部中CaMKIIα的水平显著下调,也同时显著降低可卡因的觅药动机。上面陈述的可卡因长期诱导的伏隔核CaMKIIα对大鼠可卡因自身给药觅药动机的调控作用已作为相关探讨的一部分发表在Neuropsychopharmacology (IF=6.6993)上本探讨表明长期给药能调控伏隔核多种miRNA前体的水平,其中miR-218发生下调并参与奖赏行为的负性调控。miR-218可以调节神经突触可塑性相关基因的表达,其中GluR2与GABAB3是miR-218的靶基因。进一步探讨发现伏隔核中GluR2的mRNA水平与,诱导的CPP评分成正相关。上面陈述的结果说明,药物诱导miR-218水平的变化在奖赏行为中发挥重要作用。此外,我们还发现可卡因长期给药能诱导伏隔核CaMKIIα等成瘾相关基因启动子区H3乙酰化和转录激活,而下调伏隔核中CaMKIIα的表达能降低可卡因觅药动机,说明药物诱导的组蛋白乙酰化和基因转录激活调控觅药动机。这些结果说明成瘾性药物诱导的基因表达调控在药物奖赏中有重要作用。关键词：论文自身给药论文条件位置偏爱论文miRNA论文伏隔核论文组蛋白乙酰化论文
英文缩略词表4-5
中文摘要5-9
英文摘要9-13
前言13-15
材料和策略15-32
实验结果32-65
1. 长期给药诱导的大鼠伏隔核miR-218下调及其对奖赏行为的调控32-46
1.1 长期给药调控伏隔核中多种miRNA水平32-36
1.2 长期给药下调伏隔核中miR-218成熟体的水平36-39
1.3 构建并验证miR-218-Lv和anti-miR-218-Lv39-42
1.4 伏隔核中miR-218对大鼠CPP和自给药行为的负性调控42-44
1.5 伏隔核中miR-218水平转变不影响大鼠蔗糖自给药和八臂迷宫行为44-46
2. 筛选miR-218的下游靶基因46-58
2.1 筛选miR-218调控的基因46-51
2.2 GluR2和GABRB3是miR-218的靶基因51-54
2.3 长期给药诱导伏隔核中GluR2的表达上调54-56
2.4 伏隔核中GluR2水平与CPP评分正相关56-58
3. 可卡因长期给药诱导伏隔核组蛋白乙酰化升高和CaMKIIα转录激活参与觅药动机的调控58-65
3.1 可卡因长期给药上调伏隔核的成瘾相关基因启动子区组蛋白H3乙酰化水平58-61
3.2 下调伏隔核脑区壳部中CaMKIIα的表达能降低可卡因觅药动机61-65
讨论65-68