摘要：化CpG结合蛋白2(Methyl-CpG binding protein2, MECP2)是一种已知的转录抑制因子,带有两个特点性的功能域：化DNA结合域和转录抑制结构域,具有调节转录、转变染色体构象、参与RNA剪切等多种功能,在神经发育历程中起着重要的作用。大量探讨表明,MECP2基因突变与Rett综合征、孤独症、智力低下等多种神经发育性疾病相关,现已成为探讨疾病易感基因的基因型与人类多种神经发育性疾病之间联系的一个热点。药物成瘾已经成为国内外突出的社会和医学不足。长期药物成瘾不仅损害患者身心健康,也会容易传染艾滋病、诱发犯罪等,是严重的社会不稳定因素。药物成瘾(drug addiction)是一种以失去自我制约、强迫性反复用药为主要特点的慢性复发性脑疾病,它是遗传因素和环境因素共同作用的结果。家系调查发现,药物依赖的遗传率高达54%。人们对遗传因素在药物依赖中的作用关注度逐渐升高。近年来,对药物依赖的探讨已取得了相当大的进展,但依赖的机制仍未完全阐明,不少治疗策略虽起到一定的作用,但总体疗效欠佳。只有彻底搞清成瘾的生物学机制；才能找到有效的治疗和预防策略。有探讨表明MECP2基因与BDNF (Brain-derived neurotrophic factor)基因为药物依赖的易感基因,但现有的探讨多数是生理学和形态学上的,而基因多态性与药物依赖之间的关联探讨尚无报道。本课题探讨了MECP2基因和BDNF基因多态性与依赖的关联性,以便于能够更好的了解成瘾的遗传机制。对32名健康对照者的MECP2基因和BDNF基因进行测序浅析,找到SNP位点；在331名依赖者和325名健康对照者中,用SNaPshot技术进行基因分型；根据调查量表信息将病例组中的男性患者分为高低剂量两组；用Haploview4.2及SPSS15.0软件浅析SNP与药物依赖的相关性。结果发现MECP2基因rs2075597、rs61751363和rs189253298的基因型及等位基因频率在依赖组与对照组中分布差别不显著,而rs189253298基因型频率在低剂量组和高剂量组中的分布差别显著,有统计学作用(P=0.012)。这表明MECP2基因的rs189253298多态性位点与依赖者成瘾后每天的利用量相关,携带有G等位基因的个体每天利用的量较低,是一个保护因素。BDNF基因的rs11030102的等位基因频率在依赖组与对照组中分布差别显著,有统计学作用(P0.05)。rs11030101和rs7124442基因型频率在低剂量组和高剂量组中的分布差别显著(P=0.033,P=0.032)。表明BDNF基因的rs11030102多态性位点与依赖相关,rs11030101和rs7124442多态性位点与依赖者成瘾后每天的利用量相关,携带有T、G等位基因的个体每天利用的量较低,是一个保护因素。孤独症一般起病于婴幼儿时期,是一种以语言障碍、社交障碍和刻板狭隘的兴趣为基本临床特点的广泛性发育障碍(Pervasive developmental disorder,PDD),常常合并精神发育迟滞、感知觉和情绪等方面异常。严重影响儿童身心进展。目前认为它是由遗传、神经生化、病毒感染、免疫系统等多种因素所引起的,其中遗传因素在孤独症的发病中占有重要的地位。近年来的流行病学探讨发现孤独症的患者数正逐年增加。一般孤独症的男性患者多于女性患者,二者的比例接近4：1,这表明孤独症的发病理由可能与X染色体相关,另外孤独症和Rett综合征均属于广泛性发育障碍(PDD),二者的许多临床体现比较相似。据此人们推测孤独症与RTT可能具有某些共同的发病机制。而MECP2基因是目前RTT已经确认的主要致病基因,于是MECP2基因的突变在孤独症中的作用成为探讨的热点。本课题在288个孤独症患者与384个正常对照者样本中对MECP2基因进行测序,发现了5个错义突变(T197M、G232A、H371R、E394K、G428S),对其进行功能探讨发现,这五个突变并不影响MECP2蛋白的正确定位,而Real-Time PCR的结果表明T197M、G232A是比较严重的转录抑制功能突变,而另外三个并不是完全的转录抑制突变,可能与其他功能有关。另外我们还在288个孤独症患者中检测了MECP2基因拷贝数的变异,在两个孤独症患者中检测到MECP2基因有着一个拷贝数的缺失。这表明MECP2基因的突变与孤独症之间有着一定的关联性。关键词：药物依赖论文化CpG结合蛋白2(MECP2)论文脑源性神经生长因子(BDNF)论文单核苷酸多态性(SNP)论文孤独症论文
摘要3-5
Abstract5-11
第1章 引言11-21
1.1 药物依赖11-13
1.1.1 药物依赖概述11-12
1.1.2 药物依赖分类12
1.1.3 药物依赖的作用机制12-13
1.2 MECP2基因与BDNF基因13-15
1.2.1 MECP2基因结构13-14
1.2.2 MECP2基因功能14-15
1.2.3 BDNF基因结构和功能15
1.3 单核苷酸多态性15-17
1.3.1 单核苷酸多态性概述15-16
1.3.2 单核苷酸多态性分类16
1.3.3 多态性位点的连锁不平衡16-17
1.4 孤独症17-19
1.4.1 孤独症概述17-18
1.4.2 孤独症的遗传因素18-19
1.5 立题依据19-21
第2章 MECP2基因与药物依赖21-37
2.1 探讨对象21-22
2.2 主要试剂和材料22
2.3 主要仪器设备22-23
2.4 探讨策略23-32
2.4.1 基因组DNA的提取23
2.4.2 MECP2基因的直接测序23-27
2.4.3 MECP2基因多态性位点的SNaPshot分型27-32
2.4.4 统计学浅析32
2.5 结果32-36
2.5.1 MECP2基因测序32
2.5.2 MECP2基因4个SNP位点在病例对照中的关联浅析32-34
2.5.3 MECP2基因4个SNP位点在高低剂量组的关联浅析34-35
2.5.4 MECP2基因3个SNP位点单倍型的关联浅析35-36
2.6 讨论36-37
第3章 BDNF基因与药物依赖37-45
3.1 探讨对象37-38
3.2 主要试剂和材料38
3.3 主要仪器设备38
3.4 探讨策略38-41
3.4.1 基因组DNA的提取38
3.4.2 BDNF基因的直接测序38-40
3.4.3 BDNF基因多态性位点的SNaPshot分型40
3.4.4 统计浅析40-41
3.5 结果41-43
3.5.1 BDNF基因测序41
3.5.2 BDNF基因14个SNP位点在病例对照中的关联浅析41-42
3.5.3 BDNF基因14个SNP位点在高低剂量组的关联浅析42-43
3.5.4 BDNF基因14个SNP位点单倍型的关联浅析43
3.6 讨论43-45
第4章 MECP2基因与孤独症45-63
4.1 探讨对象45-46
4.2 主要试剂和材料46
4.3 主要仪器设备46
4.4 探讨策略46-54
4.4.1 提取基因组DNA47
4.4.2 MECP2基因的测序47
4.4.3 MECP2基因与BDNF基因CNV检测47-49
4.4.4 pRK5-HA-MECP2表达载体构建49-50
4.4.5 表达载体的定点诱变50-51
4.4.6 免疫染色51-52
4.4.7 RT-PCR52-54
4.5 结果54-61
4.5.1 MECP2基因测序54-56
4.5.2 MECP2基因错义突变的功能预测及其蛋白序列保守性浅析56-58
4.5.3 MECP2基因CNV检测结果58
4.5.4 核定位结果58-59
4.5.5 RT-PCR结果59-61
4.6 讨论61-63
总结63-65
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