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试述海风藤纤丝状Aβ_(142)和Aβ_(142)寡聚体诱导阿尔茨海默氏病模型大鼠行为学、海马超微结构变化、炎症因子表达与海风藤干预学术

收藏本文 2024-02-09 点赞:34306 浏览:136026 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:探讨背景:阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是中枢神经系统最常见的变性疾病,其典型的临床体现为进行性加重的记忆力减退、认知功能障碍、行为异常和社交障碍。主要的病理转变为神经纤维缠结(neurofibrillarytangle,NFT)、老年斑形成(senileplaque, SP)和神经元缺失。AD的发病机制复杂,病因至今不清,自20世纪80年代以来形成了各种检测说,目前普遍公认的是β淀粉样蛋白β-amyloid protein, Aβ)检测说,Aβ是SP的主要组成成分,由β淀粉样蛋白前体蛋白(Aβ precursor protein, APP)通过β、γ分泌酶水解产生。AD的发生、进展与Aβ因代谢障碍而在基底前脑异常沉积密切相关。而且近年来的探讨发现,与纤丝状Aβ相比较Aβ寡聚体具有更高的神经毒性,是AD发病历程中的主要毒性物质。只是目前Aβ寡聚体的整体动物行为学实验结果还有着争议,不同聚集形式Aβ之间整体动物水平上的比较探讨也较少。目前关于AD发病历程的探讨提示,Aβ激活胶质细胞诱发中枢神经系统慢性炎症损伤可能是导致AD的一个核心病理环节,参与该炎性反应的主要是小胶质细胞(microgpa, Mi),位于Mi表面的Toll样受体(Toll—pke receptors, TLRs)及其辅助受体CD14共同参与了Aβ激活Mi的历程,但是上面陈述的结论多来自纤丝状Aβ的探讨,TLRs能否识别寡聚体的Aβ还没有定论。此外,AD的基础探讨历程中动物模型的建立一直是关键,但是目前各类模型都存不足,还没有任何一种动物模型能全面再现、模拟AD的病理、生化、行为学等方面的全部特点。本实验利用微渗泵将Aβ1-42聚合体和寡聚体持续灌注至大鼠侧脑室建立AD模型,以而使大量Aβ缓慢持续弥散性地分布到老龄大鼠脑内,较好地解决了同类模型Aβ短时在注射点局部聚集的不足,与AD的临床病理历程更接近。中药海风藤是胡椒属植物风藤的滕的茎,中国药典记载其具有通经络、祛风湿和止痹痛的功效,现代医学探讨发现其具有抗炎和神经保护作用,近年来开始运用于AD的治疗探讨。本探讨运用纤丝状Aβ1-42和Aβ1-42寡聚体侧脑室持续灌注制备AD大鼠模型,观察两种不同聚集形式的Aβ对大鼠行为学、海马区神经细胞超微结构及Toll样受体4(Toll—pke receptor4,TLR4)等炎症因子表达的影响,同时运用海风藤提取物干预治疗,观察其对上面陈述的指标的作用,以期进一步揭示AD的发病机制、探寻安全有效的治疗策略。目的:探讨纤丝状Aβ1-42与Aβ1-42寡聚体对大鼠行为学、海马区神经细胞超微结构及TLR4、核因子-KB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosiactor-α,TNF-α)表达的影响;探讨运用海风藤干预后上面陈述的指标的变化。策略:健康雄性SD大鼠60只,随机数字表法平均分为10组:正常对照组(Control组)、检测手术组(Sham组)、纤丝状Aβ+载体1组(FAβ组,脑室内灌注纤丝状Aβ+乙腈和三氟乙酸造模)、纤丝状Aβ+海风藤提取物(Piper kadsura ohwi PKO)组(FAβ+PKO组,脑室内灌注纤丝状Aβ+乙腈和三氟乙酸造模,腹腔注射PKO治疗)、纤丝状Aβ+二亚砜(Dimethyl sulfoxide DMSO)组(FAβ+DMSO组,脑室内灌注纤丝状Aβ+乙腈和三氟乙酸,腹腔注射DMSO).载体1组(Veh1组,脑室内不注射Aβ,仅灌注乙腈和三氟乙酸)、Aβ寡聚体+载体2组(AβO组,脑室内灌注Aβ寡聚体+高密度脂蛋白和羟乙基哌嗪乙磺酸造模)、Aβ寡聚体+PKO(A βO+PKO组,高密度脂蛋白和羟乙磺酸造模,腹腔注射PKO治疗)、Aβ寡聚体+DMSO组(AβO+DMSO(?)(?),脑室内灌注Aβ寡聚体+高密度脂蛋白和羟乙基哌嗪乙磺酸,腹腔注射DMSO)、载体2组(Veh2组,脑室内不注射Aβ,仅灌注高密度脂蛋白和羟乙基哌嗪乙磺酸)。采取微渗泵向侧脑室持续灌注纤丝状Aβ1-42或Aβ1-42寡聚体法制作动物模型。造模后每天给FAβ+PKO组和AβO+PKO组大鼠腹腔注射浓度10%含2.5%DMSO的PKO,按体重给药(1ml/100g),FAβ+DMSO组和AβO+DMSO组大鼠每天仅给予2.5%DMSO(?)腹腔注射(1ml/100g),连续给药35天。造模后第31天开始进行Morris水迷宫实验评定大鼠的学习记忆功能,喧闹验分为空间探讨和定向航行两部分。空间探讨实验时记录大鼠的逃避潜伏期,定向航行实验时录制大鼠在水迷宫游动视频,计算其穿越平台次数,在平台所在象限穿行的时间比率和路程比率。电镜观察海马区神经细胞超微结构,实时荧光定量聚合酶链式扩增反应(real-timepolymerasechainreactio,RT-PCR)法检测海马区TLR4mRNA表达,免疫印迹法(Western blot,WB)检测NF-κBP65、TLR4蛋白表达,酶标记免疫吸附法(ELISA)检测INF-α的表达。结果:(1)水迷宫实验结果:Control组、Sham组、Veh1组和Veh2组之间比较逃避潜伏期、穿越平台的次数、时间比率和路程比率无显著性差别(P均0.05);FAβ组与FAβ+DMSO组比较、AβO组与AβO+DMSO组比较逃避潜伏期、穿越平台的次数、时间比率和路程比率无显著性差别(P均0.05);FAβ组、FA β+DMSO组和AβO组、A β O+DMSO组与Control组、Sham组、Veh1组和Veh2组比较逃避潜伏期显著延长、穿越平台的次数显著减少、时间比率和路程比率也显著减低(P均0.05);AβO组与FAβ组比较逃避潜伏期显著延长、穿越平台的次数显著减少、时间比率和路程比率也显著减低(P均0.05);FA β+PKO组和A β O+PKO组与Control组、Sham组、Veh1组和Veh2组比较逃避潜伏期显著延长、穿越平台的次数显著减少、时间比率和路程比率也显著减低(P均0.05);但与FAβ组、FAβ+DMSO组和AβO组、A β O+DMSO组比较逃避潜伏期显著缩短、穿越平台的次数显著增加、时间比率和路程比率也显著增高(P均0.05)。(2)电镜下海马CA1区神经细胞超微结构观察:Control组、Sham组、Veh1组和Veh2组海马CA1区神经细胞超微结构未见显著异常;AβO组和A β O+DMSO组与FAβ组和FAβ+DMSO组均见到神经细胞大量凋亡和不同程度的损伤,以AβO组损伤最严重;FAβ+PKO组和AβO+PKO组均可见少量凋亡神经细胞,神经细胞损伤程度AβO组和AβO+DMSO组与FAβ组和FAβ+DMSO组较轻。(3)电镜半薄切片光镜下海纪CA1区凋亡神经细胞观察:Control组、Sham组、Veh1组Veh2组大鼠海马CA1均可见极少量凋亡神经元,但凋亡神经元数量间比较无显著性差别(P0.05); FAβ组、FAβ+DMSO组、AβO组和AβO+DMSO组大鼠海马CA1区均见大量凋亡神经元,且凋亡神经元数量较Control组、Sham组、Veh1和Veh2组显著增加(P均0.05),但FAβ组与FAβ+DMSO组比较、AβO组与A β O+DMSO组比较凋亡神经元数量无显著性差别(P均0.05);AβO组大鼠海马CA1区凋亡神经元数量较FAβ组显著增加(P0.05):FAβ+PKO组和AβO+PKO组凋亡神经元数量较Control组、Sham组、Veh1组、Veh2组增加(P均0.05),但与FAβ组、FA β+DMSO组、AβO组和A β0+DMSO组比较显著减少(P均0.05)。(4)RT-PCR、WB、ELISA结果:Comtrol组、Sham组、Veh1组和Veh2组之间比较TLR4、NF-κB、TNF-α表达无显著性差别(P均0.05);FAβ组与FAβ+DMSO组比较、AβO组与AβO+DMSO组比较TLR4、NF-κB、TNF-α表达无显著性差别(P均0.05);FAβ组、FAβ+DMSO组、AβO组和AβO+DMSO组与Control组、Sham组、Veh1组和Veh2组相比TLR4、 NF-κB、TNF-α表达均显著增强(P均0.05);AβO组TLR4、NF-κB、TNF-α表达较FAβ组增强(P0.05);FAβ+PKO组和AβO+PKO组TLR4、NF-κB、TNF-α表达较Control组、Sham组、Veh1组、Veh2组增加(P均0.05),但与FAβ组、FAβ+DMSO组、AβO组和A β O+DMSO组比较TLR4、NF-κB、TNF-α表达显著减少(P均P.05)。(5)偏相关浅析结果:TLR4、NF-κB、TNF-α与穿越平台次数都呈现负相关(P均=0.000),TLR4、 NF-κB、TNF-α之间均为正相关(P均=0.000)。结论:(1)向一侧侧脑室持续灌注八Aβ1-42能成功建立AD动物模型;(2)纤丝状Aβ1-42和Aβ1-42寡聚体均可诱导神经细胞凋亡、损伤和TLR4、 NF-κB、TNF-α表达增高,导致大鼠学习记忆功能障碍。(3)Aβ1-42寡聚体可被TLR4识别,而且与纤丝状Aβ1-42相比较,其诱导的TLR4、NF-κB、TNF-α表达理高,细胞凋亡、损伤和大鼠学习记忆功能障碍更严重。(4)海风藤干预能部分改善Aβ诱导的大鼠学习记忆功能障碍,其机制可能与减少炎症因子TLR4、NF-κB、TNF-α表达、抑制神经细胞亡有关。关键词:阿尔茨海默病论文β-淀粉样蛋白论文侧脑室持续灌注模型论文海风藤论文行为学论文炎症论文凋亡论文

    摘要6-10

    ABSTRACT10-16

    符号说明16-17

    纤丝状Aβ _(1-42)与Aβ_(1-42)寡聚体诱导阿尔茨海默氏病模型大鼠行为学、海马超微结构变化、炎症因子表达及海风藤的干预探讨17-44

    前言17-19

    材料与策略19-26

    实验结果26-29

    讨论29-32

    结论32-33

    附图33-38

    附表38-40

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