本站原创摘要3-5
Abstract5-8
英文缩略词表8-12
前言12-25
1.1 蛋白质工程介绍12-15
1.1.1 蛋白质工程的起源与目标12
1.1.2 蛋白质工程的探讨进展和运用前景12-14
1.1.3 蛋白质工程原理和基本操作14-15
1.2 同源建模、虚拟突变与分子动力学模拟15-20
1.2.1 蛋白质结构模拟15
1.2.2 同源建模15-17
1.2.3 虚拟突变17
1.2.4 分子动力学模拟17-20
1.3 基于生物催化与计算化学的蛋白分子蛋白酶抗性的理性设计20
1.4 胰蛋白酶及其催化机制20-21
1.5 木聚糖酶的介绍和蛋白质工程21-24
1.5.1 木聚糖及木聚糖酶的介绍21-23
1.5.2 木聚糖酶的蛋白质工程23-24
1.6 探讨背景、作用和实验流程24-25
第二章 实验设备、试剂及材料25-29
2.1 主要仪器设备25-26
2.2 实验材料26-29
2.2.1 菌种及载体26
2.2.2 培养基和常用试剂26-28
2.2.3 酶类28
2.2.4 试剂盒28
2.2.5 其它28-29
第三章 实验策略29-42
3.1 胰蛋白酶抗性的理性设计29-30
3.1.1 B.subtips 168 β-1,4-内切木聚糖酶 XynA 三维模型的构建29
3.1.2 胰蛋白酶水解位点的查找29
3.1.3 候选突变氨基酸残基的确定29
3.1.4 更替氨基酸的选择和突变氨基酸组合类型的确定29-30
3.2 野生型木聚糖酶 XynA 重组菌的构建及重组子的鉴定30-32
3.2.1 Bacillus subtips 168 基因组的提取[63]30
3.2.2 XynA 全长基因的扩增30-31
3.2.3 @@@a-XynA 重组质粒的构建及转化31-32
3.3 BL21(DE3)-@@@a-XynA 诱导表达和酶学性质浅析32-35
3.3.1 XynA 诱导表达条件的探讨32
3.3.2 SDS-PAGE检测表达产物32-33
3.3.3 XynA 的诱导表达33
3.3.4 XynA 的纯化、浅析和鉴定33-34
3.3.5 XynA 酶学性质浅析34-35
3.4 单点突变体 XynA**重组菌的构建和重组子的鉴定35-36
3.4.1 单点突变（**）引物设计35
3.4.2 重叠延伸 PCR (over-lap PCR) 法定点突变35
3.4.3 XynA**全长基因的获得35
3.4.4 PCR 产物纯化回收35
3.4.5 @@@a-XynA**重组质粒的构建及转化35-36
3.5 BL21(DE3)-@@@a-XynA**的诱导表达和酶学性质的浅析36-37
3.5.1 单点突变体重组质粒转化 BL21(DE3)诱导表达36
3.5.2 XynA**的纯化、浅析与鉴定36-37
3.5.3 XynA**酶学性质浅析37
3.6 两点组合突变体 XynA**/**重组菌的构建和重组子的鉴定37-39
3.6.1 两点组合突变（**/**）引物的设计37
3.6.2 重叠延伸 PCR (over-lap PCR) 法定点突变37
3.6.3 XynA**/**全长基因的获得37-38
3.6.4 PCR 产物纯化回收38
3.6.5 @@@a-XynA**/**重组质粒的构建及转化38-39
3.7 BL21(DE3)-@@@a-XynA**/**的诱导表达和酶学性质的浅析39
3.7.1 两点突变体重组质粒转化 BL21(DE3)诱导表达39
3.7.2 XynA**/**的纯化、浅析与鉴定39
3.7.3 XynA**/**酶学性质浅析39
3.8 突变体 XynA**重组菌的构建和重组子的鉴定39-41
3.8.1 突变（**）引物的设计39-40
3.8.2 重叠延伸 PCR (over-lap PCR) 法定点突变40
3.8.3 XynA**全长基因的获得40
3.8.4 PCR 产物纯化回收40
3.8.5 @@@a-XynA**重组质粒的构建和转化40-41
3.9 BL21(DE3)-@@@a-XynA**的诱导表达和酶学性质的浅析41-42
3.9.1 突变体 XynA**重组质粒转化 BL21(DE3)诱导表达41
3.9.2 XynA**的纯化、浅析与鉴定41
3.9.3 突变体 XynA**酶学性质浅析41-42
第四章 实验结果42-50
4.1 胰蛋白酶抗性的理性设计42-43
4.1.1 B.subtips 168 β-1,4-内切木聚糖酶 XynA 三维模型的构建42
4.1.2 木聚糖酶 XynA 候选突变位点的选择和突变类型的确定42
4.1.3 模拟突变和选择突变体42-43
4.1.4 分子动力学模拟评价突变体的稳定性43
4.1.5 野生型与突变型的结构比对43
4.2 野生型 XynA 重组菌的构建及蛋白诱导表达纯化43-45
4.2.1 基因组 DNA 的提取43
4.2.2 PCR 获得野生型全长基因43-44
4.2.3 重组子 pMD18-T-XynA 鉴定及序列测定44
4.2.4 重组子@@@a-XynA 的鉴定及测序44-45
4.2.5 XynA 诱导表达条件的探讨45
4.2.6 XynA 的纯化45
4.3 单点突变体 XynA**重组菌的构建和蛋白诱导表达纯化45-46
4.3.1 重叠延伸 PCR 获得单点突变体突变基因45
4.3.2 重组子@@@a-XynA**的鉴定及测序45-46
4.3.3 改良酶 XynA**的纯化46
4.4 组合突变体 XynA**/**重组菌的构建和蛋白诱导表达纯化46-47
4.4.1 重叠延伸 PCR 获得两点组合突变体突变基因46
4.4.2 重组子@@@a-XynA**/**的鉴定及测序46
4.4.3 改良酶 XynA**/**的纯化46-47
4.5 突变体 XynA**重组菌的构建和蛋白诱导表达纯化47
4.5.1 重叠延伸 PCR 获得单点突变体突变基因47
4.5.2 重组子@@@a-XynA**的鉴定及测序47
4.5.3 改良酶 XynA**的纯化47
4.6 野生型及突变体酶学性质浅析47-50
4.6.1 最适 pH47-48
4.6.2 最适温度48
4.6.3 pH 稳定性48
4.6.4 温度稳定性48
4.6.5 野生型及突变体在胰蛋白酶溶液中的稳定性48-49
4.6.6 储藏稳定性49-50
第五章 讨论50-54
5.1 理性设计中突变位点的选择和突变体组合类型的确定50
5.1.1 突变位点的选择50
5.1.2 突变体组合类型的确定50
5.2 突变类型与突变体的性质50-52
5.2.1 单点突变50-51
5.2.2 两点联合突变51
5.2.3 内部对照突变51-52
5.3 重叠延伸 PCR 定点突变52
5.4 酶的诱导表达与纯化52-54
总结与展望54-55