本站原创摘要5-6
Abstract6-10
第1章 前言10-21
1.1 螺旋霉素介绍10
1.2 螺旋霉素的结构10-13
1.3 螺旋霉素生物合成的相关基因簇13-16
1.4 螺旋霉素在生物体内的合成途径16-20
1.5 探讨的主要作用和内容20-21
第2章 材料和策略21-40
2.1 实验材料21-30
2.1.1 菌株21-22
2.1.2 质粒22-23
2.1.3 引物23-25
2.1.4 主要仪器25-26
2.1.5 药品及试剂26-27
2.1.6 主要的缓冲液和溶剂27-28
2.1.7 培养基28-29
2.1.8 抗生素29-30
2.2 实验策略30-40
2.2.1 Ca法即时感受态的制备30
2.2.2 Inoue大肠杆菌超级感受态的制备30
2.2.3 感受态大肠杆菌的细胞转化30-31
2.2.4 大肠杆菌中质粒DNA的少量提取31
2.2.5 DNA电泳31
2.2.6 小片段DNA琼脂糖凝胶回收(一般小于5kb)31-32
2.2.7 DNA酶切32
2.2.8 DN段的连接32
2.2.9 PCR反应系统和PCR反应32-33
2.2.10 生二素链霉菌总DNA的制备33-34
2.2.11 生二素链霉菌与大肠杆菌的属间接合转移34-35
2.2.12 生二素链霉菌的发酵及发酵液的检测35-36
2.2.13 构建生二素链霉菌基因文库36-39
2.2.14 文库筛选39-40
第3章 遗传转移系统的建立与优化40-45
3.1 生二素链霉菌S.ambofaciens菌体的抗生素抗性探讨40
3.2 载体的选择40-41
3.3 供体菌的选择41
3.4 大肠杆菌和生二素链霉菌的属间接合转移41-42
3.5 检测接合子42-43
3.6 总结43-45
第4章 基因文库的构建45-57
4.1 螺旋霉素基因组文库的建立45-51
4.1.1 总DNA的打断45-47
4.1.2 蔗糖的密度梯度离心47-49
4.1.3 PJTU2554载体的预处理49
4.1.4 处理过后的总DNA与载体的连接49-50
4.1.5 包装转染和文库多样性测试50-51
4.2 生二素链霉菌基因簇的筛选51-56
4.2.1 原位杂交51-52
4.2.2 PCR验证和筛选52-56
4.3 小结56-57
第5章 螺旋霉素生物合成基因簇中推测修饰性基因orf1的倍增和敲除57-67
5.1 pSET空质粒导入到链霉菌中的属间接合转移57-59
5.1.1 S.LpSET菌株的验证和发酵57-58
5.1.2 突变株发酵和检测58-59
5.2 orf1基因的倍增59-64
5.2.1 基因的倍增质粒构建的示意图及对策60-61
5.2.2 基因orf1倍增突变株的筛选和发酵61-62
5.2.3 发酵液的测定62-64
5.3 orf1基因的敲除64-66
5.3.1 基因的敲除质粒构建的示意图及对策64-65
5.3.2 发酵的检测65-66
5.4 小结66-67
第6章 螺旋霉素生物合成基因簇中推测修饰性基因orf1~*c的倍增和敲除67-72
6.1 orf1~*c基因的倍增67-69
6.1.1 倍增突变株的构建67
6.1.2 基因orf1~*c倍增突变株的筛选和发酵67-68
6.1.3 发酵液的测定68-69
6.2 orf1~*c基因的敲除69-71
6.2.1 orf1~*c基因的双交换敲除构建对策69-70
6.2.2 发酵液的测定70-71
6.3 小结71-72
第7章 螺旋霉素生物合成基因簇中推测修饰性基因orf9c的敲除与orf31的倍增和敲除72-78
7.1 基因orf9c的敲除72-73
7.1.1 构建的基因orf9c双交换突变株72-73
7.1.2 发酵液的测定73
7.2 基因orf31的倍增73-75
7.2.1 倍增突变株的获得73-74
7.2.2 发酵液的生测和LC-MS检测74-75
7.3 orf31基因的敲除75-77
7.3.1 orf31基因的敲除菌株的构建76-77
7.4 小结77-78
第8章 结论与展望78-79
8.1 结论78
8.2 展望78-79