摘要：D-乳酸是一种重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料，利用微生物代谢廉价底物，高效合成具有极高光学纯度和极高化学纯度的D-乳酸，是实现其工业运用的基本要素。大肠杆菌(Escherichia cop)可以作为D-乳酸合成的重要微生物，但野生型菌株进行D-乳酸发酵合成时，发酵液中副产物含量较高、乳酸转化率和合成速率低，必须通过有效代谢途径的改造或修饰，以提升D-乳酸发酵生产的化学纯度。此外，像其他的有机酸等发酵历程一样，乳酸发酵历程中也有着典型的细胞生长与产物形成间的代谢与制约矛盾，通过现代工业微生物育种论述与技术，解决这一发酵工业中具有普遍性的不足，以期D-乳酸发酵工艺历程的实施与历程制约更为顺畅和高效。本论文利用基因工程和代谢工程原理与技术，革新性地进行了野生大肠杆菌(CICIMB0013)乳酸合成相关竞争途径中酶基因的删除，并对乳酸合成速率进行精细调节和开关式制约使其与细胞活性相协调，获得了以较高细胞活性和高合成效率制造极高光学纯度和极高化学纯度D-乳酸的生产菌株，探讨结果可经进一步工艺探讨与放大后运用于D-乳酸的工业化制备。本探讨获得主要结果如下：1.考察了10个乳酸合成竞争代谢途径中酶基因的删除对乳酸合成代谢的作用，构建获得D-乳酸产量高、副产物合成量低的重组大肠杆菌。在建立大肠杆菌多位点高效基因删除策略的基础上，将D-乳酸合成竞争途径：乙酸激酶(ackA)、磷酸转乙酰酶(pta)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)、FAD依赖型D-乳酸脱氢酶(dld)、丙酮酸氧化酶(poxB)、乙醇脱氢酶(adhE)、富马酸还原酶(frdA)、丙酸激酶(tdcD)、丙酮酸甲酸裂解酶4(tdcE)的编码基因在菌株B0013中进行组合删除，并考察这些代谢途径的单基因删除和组合删除在D-乳酸发酵中的作用。结果表明，ackA、pta、pflB、dld、poxB和frdA的单基因删除有助于提升大肠杆菌乳酸转化率和生产强度，而pps和adhE单基因删除不利于提升乳酸的转化率和生产强度。在删除ackA基础上逐步叠加删除pta、pflB、dld、tdcDE、adhE和frdA基因能够提升乳酸的转化率或降低副产物的合成量，删除pps和poxB基因对乳酸和副产物的合成无作用，而删除tdcDE基因可降低乙酸积累量但显著影响菌体的生长速率。在菌株B0013中，删除8个基因获得菌株B0013-070(ackA-pta pps pflB dld poxB adhE frdA)。该菌株的乳酸转化率和生产强度较B0013提升了1倍，副产物乙酸、琥珀酸、甲酸和乙醇的含量分别降低了95%、89%、100%和93%。菌株B0013-070在7L发酵罐中发酵产生125g/L D-乳酸，其光学纯度大于99.9%，化学纯度达到94.2%，发酵阶段乳酸转化率达96g/100g葡萄糖，生产强度达到0.61g/g·h，是出发菌株B0013的2.1倍；进一步在产酸阶段适度增加通气量，其乳酸合成速率提升为5.5g/L·h，化学纯度达到98.4%。2. ldhA基因上游区域部分缺失可实现乳酸合成速率的精细调节与细胞活性的协调。B0013-070在乳酸发酵历程中仍然有一定量的丙酮酸积累，预示由ldhA编码的D-乳酸脱氢酶催化丙酮酸到乳酸的合成蕴含精细调节的可能。为此，将具有不同长度上游区域的ldhA基因克隆于低拷贝重组载体，并转化菌株B0013-080C (B0013-070, ldhA)。所获得菌株的发酵罐发酵结果表明，ldhA结构基因上游区域长度由291bp缩短到106bp，可降低乳酸合成对重组菌株菌体生长的抑制程度，限氧阶段乳酸合成速率依次增加。ldhA基因-96位点下游的检测定启动子可能具有转录启动或调节功能。而ldhA基因-61位点下游可能不具有转录起始区域。重组菌株B0013-080C/pTH-rrnB-ldhA8，具有72bp ldhA基因上游区域，菌体生长速率最快，且乳酸合成速率最高，达到11.7g/L·h，实现了乳酸合成与菌体生长的协调。3.对乳酸脱氢酶基因的转录进行开关设计与制约，构建了相应的重组菌，通过调控发酵培养条件可以高效、动态制约重组大肠杆菌乳酸的合成与菌体量的积累。乳酸发酵历程是一个典型的细胞生长与产物形成间的代谢与制约矛盾体，精确并简便调节这一矛盾体，可实现细胞的高速生长和乳酸的高效发酵生产。将菌株B0013-070染色体上的ldhA基因启动子(ldhAp)替换为λ噬菌体的pR-pL串联启动子，获得基于染色体水平开关制约的乳酸合成菌株B0013-070B (B0013-070, ldhAp::kan-cIts857-pR-pL)。新的重组菌的培养方式为：菌体生长阶段在33°C进行，经42°C、30min生长过渡后，转入发酵阶段。在此条件下，与菌株B0013-070好氧-限氧发酵结果相比，菌株B0013-070B好氧菌体转化率提升9%，发酵阶段体积生产强度提升了51%，D-乳酸比合成速率提升了46%，化学纯度提升到98.6%。关键词：D-乳酸论文大肠杆菌论文代谢工程论文基因开关论文D-乳酸脱氢酶论文基因删除论文ldhA启动子论文
摘要3-5
Abstract5-7
缩略词表7-11
第一章 前言11-25
1.1 工业微生物菌株育种的重要作用11
1.2 早期工业菌种选育论述和策略学的探讨历史与进展介绍11-17
1.2.1 诱变育种11-12
1.2.2 基因重组育种12
1.2.3 基因工程和早期代谢工程育种对策12-17
1.3 后基因组时代下的工业微生物菌种育种新论述新对策介绍17-23
1.3.1 高通量组学浅析技术在育种中的运用17-18
1.3.2 基因组水平代谢网络模型指导育种18
1.3.3 系统代谢工程育种对策18
1.3.4 合成生物学育种对策18-19
1.3.5 协调产物合成与菌株活性的新育种策略19-23
1.4 立题依据与主要探讨内容23-25
第二章 大肠杆菌多位点高效基因删除策略的建立25-35
2.1 前言25-26
2.2 材料与策略26-28
2.2.1 菌株和质粒26
2.2.2 引物26-27
2.2.3 试剂与仪器27
2.2.4 培养基27
2.2.5 Red 重组系统的诱导27-28
2.2.6 电转化感受态细胞的制备、电击转化及转化子的筛选28
2.2.7 抗性筛选标记的拯救28
2.3 结果与讨论28-33
2.3.1 基于 Red 和 Xer 重组系统的基因删除28-30
2.3.2 菌株 E. cop B0013 中 ackA-pta 基因的删除30-31
2.3.3 菌株 E. cop B0013-010 中 pps 基因的删除31-33
2.4 本章小结33-35
第三章 竞争代谢途径中多基因的删除提升 D-乳酸合成质和量35-59
3.1 前言35-37
3.2 材料与策略37-42
3.2.1 菌株与质粒37
3.2.2 引物37
3.2.3 试剂与仪器37-38
3.2.4 多基因删除菌株的构建38-40
3.2.5 发酵试验40-41
3.2.6 生物量测定41
3.2.7 葡萄糖浓度测定41
3.2.8 发酵液样品浅析41-42
3.2.9 乳酸光学构型浅析42
3.3 结果与讨论42-57
3.3.1 大肠杆菌中心代谢途径的多个基因的组合删除42-46
3.3.2 代谢途径的单基因删除可显著影响乳酸合成46-47
3.3.3 代谢途径编码基因删除的组合可提升乳酸合成速率和质量47-50
3.3.4 低供氧发酵可提升 D-乳酸合成速率50-57
3.4 本章小结57-59
第四章 ldhA 基因转录水平的微调节59-75
4.1 前言59-60
4.2 材料与策略60-62
4.2.1 菌株和质粒60-61
4.2.2 引物61
4.2.3 试剂与仪器61
4.2.4 分子操作61-62
4.2.5 DNA 序列测定与浅析62
4.2.6 培养基与培养策略62
4.2.7 启动子预测策略62
4.2.8 其它浅析策略62
4.3 结果与讨论62-74
4.3.1 菌株 B0013 ldhA 基因上游序列的测定及浅析62-65
4.3.2 ldhA 基因上游区域部分缺少重组菌株的构建65-67
4.3.3 ldhA 基因上游区域部分缺失可降低好氧阶段乳酸的合成67-69
4.3.4 ldhA 基因-96 位点下游仍具有转录启动区域69-70
4.3.5 ldhA 基因-61 位点下游不具有转录启动区域70-74
4.4 本章小结74-75
第五章 温控开关的组装实现 D-乳酸高效生物合成75-93
5.1 前言75-76
5.2 材料与策略76-78
5.2.1 菌株和质粒76
5.2.2 引物76-77
5.2.3 试剂与仪器77
5.2.4 分子操作77
5.2.5 培养基与培养策略77-78
5.2.6 乳酸脱氢酶酶活测定78
5.2.7 其它浅析策略78
5.3 结果与讨论78-89
5.3.1 乳酸脱氢酶基因转录制约方式的选择78-82
5.3.2 温控开关制约乳酸合成菌株 B0013-070B 的构建82-85
5.3.3 B0013-070B 重组菌的 D-乳酸发酵性能85-89
5.4 本章小结89-93
结论93-95
论新点95-96
致谢96-98
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