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[摘要] 目的 研究异甜菊醇在大鼠肝脏内的代谢情况。 策略 给予SD大鼠离体肝灌流（ILP）行异甜菊醇的初步药动学研究（体外试验）。分离5只大鼠肝脏然后用含有异甜菊醇的介质进行循环灌流，在时间为0、1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60 min时收集灌流液样品，每间隔10 min收集胆汁样品，样品用Hplc-UV分析。尿液（前面实验收集）、灌流液和胆汁样品用β-葡萄糖醛酸酶（1.3 U/μL）培养再进行HPLC-UV分析。 结果 40～50 min后的灌流液中，HPLC法检测不到异甜菊醇，而胆汁中完全没有检测到。灌流液和胆汁分别经过β-葡萄糖醛酸酶/硫酸根培养后，色谱策略与灌流液的一样保持不变，胆汁样品中得到了明显的异甜菊醇峰。60 min中的药动学参数T1/2、AUClast、Vz（obs）、CLH、EH（肝脏提取率）和回收率（R0～60：代谢率）分别为：（17.82±2.5）min、（258.18±33.2）min·μg/mL、（425.35±32.1）mL、（17.7±2.2）mL/min、（0.59±0.07）和（18.08±2.5）。 结论 经过40～50 min灌流后异甜菊醇主要在肝脏中积累，以葡萄苷酸化形式从胆汁排泄，很可能大部分经过胆汁排泄慢慢的消除到粪便中。
[关键词] 异甜菊醇；离体肝灌流；结合物
[] A [文章编号] 1673-7210（2013）10（c）-0144-04
异甜菊醇是蛇菊苷的一个衍生物，是一个从植物甜菊提取的不含卡路里的增甜剂。异甜菊醇在高血压、炎性疾病、糖尿病和癌症的治疗中具有潜在疗效而被作为一个候选药物。最近研究显示异甜菊醇能降低Zucker糖尿病大鼠的血糖浓度[1]，并减少SD大鼠由局部缺血-在灌注引起的心脏损伤[2]，它还抑制肿瘤启动剂在拉吉细胞中的激活[3]。关于异甜菊醇微生物转化的文献显示异甜菊醇由游动放线菌属和毛霉菌属代谢[4]。和甜菊糖醇一样，异甜菊醇同样也是蛇菊苷的一个代谢组分[5]，研究显示甜菊糖醇在大鼠肝脏中的积累在注射10 min后是最高的。通过前期研究推断甜菊糖醇代谢产物在胆汁中可能发生共轭作用。近来更多的研究显示蛇菊苷和甜叶菊甙A在大鼠中代谢为甜菊糖醇[6]。然而，异甜菊醇在组织和器官中的药动学至今还未研究过，而药物大多数在肝脏中代谢，因此，在本次实验中异甜菊醇初步药动学研究在SD大鼠离体肝灌流（ILP）中进行。弄清甜菊糖醇在大鼠离体肝中的代谢研究对将其开发为新药具有非常重要的作用。
1.2 试药
灌流之前每只大鼠腹腔注射钠60 mg/kg麻醉，然后按照文献[7]所述策略进行ILP实验，整个循环灌流过程保持37℃。灌流液为不含红细胞-/白蛋白的Kreb′s-Henseleit碳酸氢盐缓冲液，葡萄糖为16.5 mmol/L，牛磺胆酸钠为8.33 μmol/L，pH为7.4～7.5；灌流过程中，灌流液的pH值通过5%CO2和95%O2保持，肝脏灌流速度为30 mL/min。用不含药物的空白灌流液平衡20 min后，用250 异甜菊醇在大鼠离体肝灌流中的药代动力学论文资料由论文网www.udooo.com提供,转载请保留地址.mL含有20 μg/mL的异甜菊醇灌流液对肝脏进行循环灌流60 min。在时间为0、1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60 min时收集灌流液样品，每间隔10 min收集胆汁样品，样品用Hplc-UV检测。
3 讨论
本次体外研究，通过分离5只大鼠肝脏并灌流来研究异甜菊醇在SD大鼠中的初步药动学。非肾消除似乎是异甜菊醇的主要代谢途径。如图1所示，每只试异甜菊醇在大鼠离体肝灌流中的药代动力学论文资料由论文网{#GetFullDomain}提供,转载请保留地址.验大鼠在开始灌流后异甜菊醇的浓度迅速下降，40 min后在灌流液中检测不到异甜菊醇，很可能是异甜菊醇经过肝脏迅速地消除了，60 min内任何时间段收集到的胆汁样品中都没有检测到异甜菊醇。然而，灌流液和胆汁样品分别经过β-葡糖醛酸糖苷酶/硫酸盐（1.3 U/μL）培养后只有胆汁在异甜菊醇的保留时间出现了明显的高峰，这个结果显示异甜菊醇的主要消除途径为葡萄苷酸化而不是胆汁排泄；经过40～50 min灌流后异甜菊醇主要积累在肝脏中。至今为止肝脏对异甜菊醇的处置还没进行过，然而，早期在大鼠中进行的甜菊糖醇体内研究中发现胆汁中存在未知的甜菊糖醇络合物，近来更多的研究也发现在大鼠体内蛇菊苷和甜叶菊苷代谢为甜菊糖醇葡萄糖醛酸苷，而异甜菊醇似乎也享有与甜菊糖醇相同的代谢途径，可能的解释为它们的化学结构基本相同[5]，即使异甜菊醇和甜菊糖醇在胆汁中的结合物的比例不同。在早期研究中蛇菊苷给药后在人尿中发现了甜菊糖醇葡萄糖醛酸苷[15]。进一步研究中人体受试者接受口服蛇菊苷750 mg/d连续3 d，在血液和尿液总之发现了甜菊糖醇葡萄糖醛酸苷这唯一代谢物，没有检测到蛇菊苷和甜菊糖醇[16]。蛇菊苷和甜菊糖醇的代谢研究已经进行过[17-18]。根据灌流液和胆汁β-葡糖醛酸糖苷酶/硫酸盐培养结果，异甜菊醇经历了结合-解离循环，异甜菊醇在肝脏中代谢然后以葡萄糖醛酸苷形式排入胆汁，证据是胆汁的平均回收率为18%。然而，异甜菊醇60 min内的EH为0.59，但是尿液和灌流液经过培养后它们的Hplc色谱图与培养前没有差别，这些意味着异甜菊醇结合物在在循环过程中没有回到灌流液中或者通过肾脏消除。不可否认只要肝脏功能正常，当灌流过程继续进行下去会有一定比例的异甜菊醇排入胆汁，但是大部分积累在肝脏中这一点是确定的，通常人体中分子量≥600 Da以及大鼠中325 Da的有机阴离子会排入胆汁而不是通过肾脏消除[5]。因此，异甜菊醇被肝脏吸收，随后被代谢，经过普遍的Ⅱ相反应迅速生成水溶性代谢物，排入胆汁，这种分子量为512.9 Da的代谢物在大鼠内像甜菊糖醇葡萄苷酸化一样优先经过胆汁排泄随后消除进入粪便中。前面研究[11]证实肾脏消除的尿液中的原药异甜菊醇几乎可以忽略，此外，大鼠尿液经过培养后同样没有异甜菊醇，因此非肾消除应该是异甜菊醇处置的主要途径，因此还需要分析肝脏组织匀浆测定储存在肝细胞中的异甜菊醇，随着时间的推移肝细胞中越来越多的异甜菊醇发生络合反应生成络合物并排入胆汁最后通过粪便消除。
总之，异甜菊醇的药动学在体内和体外的特征为它在肝脏中会发生葡萄苷酸化。这表明肝脏代谢可能是异甜菊醇消除的主要途径，而异甜菊醇的肾脏消除几乎可忽略。
[参考文献]
[1] Ma JZ. Isosteviol reduces plaa glucose levels in the intrenous glucosetolerance test in Zucker diabetic fatty rats [J]. Diabetes，Obesity and Metaboli，2007，2（1）：9.
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[5] Chatsudthipong V，Muanprasat C. Stevioside and related compounds：Therapeutic benefits beyond sweetness [J]. Pharmacology & Therapeutics，2009，121（1）：41-54.[6] Roberts A，Renwick AG. Comparative toxicokinetics and metaboli of rebaudioside A，stevioside， and steviol in rats [J]. Food and Chemical Toxicology，2008，46（1）：31-39.
[7] Evans AM，Shanahan K. The disposition of morphine and its metabolites in the in-situ rat isolated perfused liver [J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology，1995，47（4）：333-339.
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[9] Shibasato M，Taneda M. Analysis of stevia glycosides（Ⅰ）： Application of high performance liquid chromatography on C18-column [J]. Seito Gijutsu Kenkyu Kaishi，1990，38：71-78.
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[11] Bazargan M，Gerber JP. Determination of isosteviol by LC-MS/MS and its application for evaluation of pharmacokinetics of isosteviol in rat [J]. Daru-Journal of Faculty of Pharmacy 2007，15（3）：146-150.
[12] Wei CI，Marshall MR. Characterization of water-soluble glucuronide and sulphate conjugates of aflatoxin B1. 1. Urinary excretion in monkey， rat and mouse. Food and chemical toxicology [J]. British Industrial Biological Research Association异甜菊醇在大鼠离体肝灌流中的药代动力学由提供海量免费论文范文的www.udooo.com,希望对您的论文写作有帮助.，1985，23（9）：809-819.
[13] Kauffman FC，Editor. Conjugation-deconjugation reactions in drug metaboli and toxicity [J]. Handb Experimental Pharmacology，1994：112.
[14] Koyama E，Sakai N. Absorption and metaboli of glycosidic sweeteners of stevia mixture and their aglycone， steviol， in rats and humans [J]. Food and Chemical Toxicology，2003， 41（6）：875-883.
[15] Geuns J，Buyse J. Identification of steviol glucuronide in human urine [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（7）：2794-2798.
[16] Geuns J，Buyse J，Vankeirsbilck A，et al. Metaboli of stevioside by healthy subjects [J]. Experimental Biology And Medicine，2007，232（1）：164-173.
[17] Geuns J，Augustijns P. Metaboli of stevioside in pigs and intestinal absorption characteristics of stevioside， rebaudioside A and steviol [J]. Food and Chemical Toxicology，2003， 41（11）：1599-1607.
[18] Wheeler，Boileau A. Pharmacokinetics of rebaudioside A and stevioside after single oral doses in healthy men [J]. Food and Chemical Toxicology，2008，46（7）：54-60.
（收稿日期：2013-05-24 本文编辑：卫 轲）
[关键词] 异甜菊醇；离体肝灌流；结合物
[] A [文章编号] 1673-7210（2013）10（c）-0144-04
异甜菊醇是蛇菊苷的一个衍生物，是一个从植物甜菊提取的不含卡路里的增甜剂。异甜菊醇在高血压、炎性疾病、糖尿病和癌症的治疗中具有潜在疗效而被作为一个候选药物。最近研究显示异甜菊醇能降低Zucker糖尿病大鼠的血糖浓度[1]，并减少SD大鼠由局部缺血-在灌注引起的心脏损伤[2]，它还抑制肿瘤启动剂在拉吉细胞中的激活[3]。关于异甜菊醇微生物转化的文献显示异甜菊醇由游动放线菌属和毛霉菌属代谢[4]。和甜菊糖醇一样，异甜菊醇同样也是蛇菊苷的一个代谢组分[5]，研究显示甜菊糖醇在大鼠肝脏中的积累在注射10 min后是最高的。通过前期研究推断甜菊糖醇代谢产物在胆汁中可能发生共轭作用。近来更多的研究显示蛇菊苷和甜叶菊甙A在大鼠中代谢为甜菊糖醇[6]。然而，异甜菊醇在组织和器官中的药动学至今还未研究过，而药物大多数在肝脏中代谢，因此，在本次实验中异甜菊醇初步药动学研究在SD大鼠离体肝灌流（ILP）中进行。弄清甜菊糖醇在大鼠离体肝中的代谢研究对将其开发为新药具有非常重要的作用。
1 动物与试药
1.1 动物
雄性SD大鼠（250～380 g）从医学和兽医科学中心获得（IMVS，Adelaide，SA，澳大利亚），在代谢笼内单独饲养，实行12 h/12 h白天/黑夜循环，自由进食标准饮食和水，室温为20～23℃。本次实验获得了动物委员会的批准。1.2 试药2 策略与结果
2.1 ILP实验
灌流之前每只大鼠腹腔注射钠60 mg/kg麻醉，然后按照文献[7]所述策略进行ILP实验，整个循环灌流过程保持37℃。灌流液为不含红细胞-/白蛋白的Kreb′s-Henseleit碳酸氢盐缓冲液，葡萄糖为16.5 mmol/L，牛磺胆酸钠为8.33 μmol/L，pH为7.4～7.5；灌流过程中，灌流液的pH值通过5%CO2和95%O2保持，肝脏灌流速度为30 mL/min。用不含药物的空白灌流液平衡20 min后，用250 异甜菊醇在大鼠离体肝灌流中的药代动力学论文资料由论文网www.udooo.com提供,转载请保留地址.mL含有20 μg/mL的异甜菊醇灌流液对肝脏进行循环灌流60 min。在时间为0、1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60 min时收集灌流液样品，每间隔10 min收集胆汁样品，样品用Hplc-UV检测。2.2 样品分析
用HPLC-UV检测灌流液和胆汁中异甜菊醇的浓度[8]。流动相为磷酸二氢钠和乙腈（45∶55，用0.1 mol/L的磷酸调节pH为4.15），色谱柱为EPS C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），预柱为C18（Alltech Associates，Deerfield，IL，美国），流速为1.0 mL/min；紫外检测波长为210 nm。在此色谱条件下，异甜菊醇的保留时间约为11 min[9-10]。标准校准样品用空白灌流液稀释浓度为100 μg/mL异甜菊醇储备液到1.5～25 μg/mL。质控样品用150 μg/mL异甜菊醇储备液稀释。收集到的灌流液和胆汁样品离心（3000×g，10 min）后取100 μL上清液进HPLC分析。2.3 β-葡糖醛酸糖苷酶培养
在体内实验中收集的尿液样品[11]以及在ILP实验中收集的胆汁和灌流液样品用β-葡糖醛酸糖苷酶培养。每个时间段的胆汁样品10 μL用240 μL空白灌流液稀释，然后250 μL尿液、灌流液和稀释的胆汁样品与40 μL的β-葡糖醛酸糖苷酶（1.3 U/μL）和210 μL的醋酸缓冲液混合，在37℃条件下培养48 h[12]。在500 μL的反应液中加入500 μL的乙腈终止培养，将这1000 μL的混合液涡旋2 min后离心30 min（10 000 × g）。取100 μL是上清液用来Hplc分析[13-14]，100 μL上清液用来LC/MS/MS进样。2.4 数据分析策略
采用非房室模型用WinNonlin 4.1（Pharsight Corporation，City，美国）分析血浆和灌流液中各个时间的异甜菊醇浓度。各组数据用平均数±标准差（x±s）表示。肝脏提取率（EH）=灌流速度/CLH，60 min内的代谢率=β-葡糖醛酸糖苷酶培养后得到的总异甜菊醇/在灌流液中加入的总异甜菊醇。2.5 结果
在ILP实验中用HPLC-UV法检测异甜菊醇，保留时间约为11 min，日内和日间精密度分别为97%～107%和91%～105%，最低检测限为1.5 μg/mL。
在肝脏灌流过程中每只大鼠的胆汁流速始终在0.5～1.1 μL/min范围内，其他的肝脏活性参数表明肝脏在灌流期间是健康的。从ILP得到的数据证实异甜菊醇是通过肝脏清除的（图1），异甜菊醇肝灌流药动学参数（n = 5）：半衰期（T1/2）=（17.8±2.5）min，药时曲线下面积（AUC0～last）=（425.4±33.2）min·μg/mL，表观分布容积（Vz）=（425.2±32.1）mL，肝清除率（CLH）=（17.7±2.2）mL/min，肝提取率EH=（0.59±0.07），代谢比率（R0～60）=（18.1±2.5）%。胆汁中检测不到异甜菊醇，然而胆汁经过β-葡糖醛酸糖苷酶培养后（图2），给药量的（18.0±2.5）%异甜菊醇被还原。这些结果表明异甜菊醇在肝脏中代谢并排到胆汁中。3 讨论
本次体外研究，通过分离5只大鼠肝脏并灌流来研究异甜菊醇在SD大鼠中的初步药动学。非肾消除似乎是异甜菊醇的主要代谢途径。如图1所示，每只试异甜菊醇在大鼠离体肝灌流中的药代动力学论文资料由论文网{#GetFullDomain}提供,转载请保留地址.验大鼠在开始灌流后异甜菊醇的浓度迅速下降，40 min后在灌流液中检测不到异甜菊醇，很可能是异甜菊醇经过肝脏迅速地消除了，60 min内任何时间段收集到的胆汁样品中都没有检测到异甜菊醇。然而，灌流液和胆汁样品分别经过β-葡糖醛酸糖苷酶/硫酸盐（1.3 U/μL）培养后只有胆汁在异甜菊醇的保留时间出现了明显的高峰，这个结果显示异甜菊醇的主要消除途径为葡萄苷酸化而不是胆汁排泄；经过40～50 min灌流后异甜菊醇主要积累在肝脏中。至今为止肝脏对异甜菊醇的处置还没进行过，然而，早期在大鼠中进行的甜菊糖醇体内研究中发现胆汁中存在未知的甜菊糖醇络合物，近来更多的研究也发现在大鼠体内蛇菊苷和甜叶菊苷代谢为甜菊糖醇葡萄糖醛酸苷，而异甜菊醇似乎也享有与甜菊糖醇相同的代谢途径，可能的解释为它们的化学结构基本相同[5]，即使异甜菊醇和甜菊糖醇在胆汁中的结合物的比例不同。在早期研究中蛇菊苷给药后在人尿中发现了甜菊糖醇葡萄糖醛酸苷[15]。进一步研究中人体受试者接受口服蛇菊苷750 mg/d连续3 d，在血液和尿液总之发现了甜菊糖醇葡萄糖醛酸苷这唯一代谢物，没有检测到蛇菊苷和甜菊糖醇[16]。蛇菊苷和甜菊糖醇的代谢研究已经进行过[17-18]。根据灌流液和胆汁β-葡糖醛酸糖苷酶/硫酸盐培养结果，异甜菊醇经历了结合-解离循环，异甜菊醇在肝脏中代谢然后以葡萄糖醛酸苷形式排入胆汁，证据是胆汁的平均回收率为18%。然而，异甜菊醇60 min内的EH为0.59，但是尿液和灌流液经过培养后它们的Hplc色谱图与培养前没有差别，这些意味着异甜菊醇结合物在在循环过程中没有回到灌流液中或者通过肾脏消除。不可否认只要肝脏功能正常，当灌流过程继续进行下去会有一定比例的异甜菊醇排入胆汁，但是大部分积累在肝脏中这一点是确定的，通常人体中分子量≥600 Da以及大鼠中325 Da的有机阴离子会排入胆汁而不是通过肾脏消除[5]。因此，异甜菊醇被肝脏吸收，随后被代谢，经过普遍的Ⅱ相反应迅速生成水溶性代谢物，排入胆汁，这种分子量为512.9 Da的代谢物在大鼠内像甜菊糖醇葡萄苷酸化一样优先经过胆汁排泄随后消除进入粪便中。前面研究[11]证实肾脏消除的尿液中的原药异甜菊醇几乎可以忽略，此外，大鼠尿液经过培养后同样没有异甜菊醇，因此非肾消除应该是异甜菊醇处置的主要途径，因此还需要分析肝脏组织匀浆测定储存在肝细胞中的异甜菊醇，随着时间的推移肝细胞中越来越多的异甜菊醇发生络合反应生成络合物并排入胆汁最后通过粪便消除。
总之，异甜菊醇的药动学在体内和体外的特征为它在肝脏中会发生葡萄苷酸化。这表明肝脏代谢可能是异甜菊醇消除的主要途径，而异甜菊醇的肾脏消除几乎可忽略。
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[10] Shibasato M，Taneda M. Analysis of Stevia glycosides（Ⅱ）： Application of high-performance liquid chromatography on C18 column [J]. Seito Gijutsu Kenkyu Kaishi，1992，40：39-46.
[11] Bazargan M，Gerber JP. Determination of isosteviol by LC-MS/MS and its application for evaluation of pharmacokinetics of isosteviol in rat [J]. Daru-Journal of Faculty of Pharmacy 2007，15（3）：146-150.
[12] Wei CI，Marshall MR. Characterization of water-soluble glucuronide and sulphate conjugates of aflatoxin B1. 1. Urinary excretion in monkey， rat and mouse. Food and chemical toxicology [J]. British Industrial Biological Research Association异甜菊醇在大鼠离体肝灌流中的药代动力学由提供海量免费论文范文的www.udooo.com,希望对您的论文写作有帮助.，1985，23（9）：809-819.
[13] Kauffman FC，Editor. Conjugation-deconjugation reactions in drug metaboli and toxicity [J]. Handb Experimental Pharmacology，1994：112.
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[15] Geuns J，Buyse J. Identification of steviol glucuronide in human urine [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（7）：2794-2798.
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[17] Geuns J，Augustijns P. Metaboli of stevioside in pigs and intestinal absorption characteristics of stevioside， rebaudioside A and steviol [J]. Food and Chemical Toxicology，2003， 41（11）：1599-1607.
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