摘要：探讨背景：慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种造血干细胞的克隆性疾病,约占成人白血病的15%-20%,是严重危害人类健康的血液系统恶性肿瘤。CML患者有着Ph染色体,即9号染色体c-ab1癌基因易位到22号染色体bcr基因处,形成bcr-abl融合基因,bcr-abl融合基因编码BCR-ABL融合蛋白,该蛋白具有酪氨酸激酶活性,推动细胞异常增殖,导致CML的发生和进展。伊马替尼(Imatinib)是一种酪氨酸激酶抑制剂,对CML患者具有良好的疗效,并于2001年获美国FDA批准成为治疗CML的一线药物。然而,已有越来越多的临床和实验探讨资料显示,伊马替尼虽然对CML慢性期患者有较好的疗效,却对急变期CML疗效较差,而且随着伊马替尼的广泛运用,发现有相当一部分患者出现耐药。探讨认为分子靶向药物对急变期CML无效主要与其致病基因bcr-abl发生突变有关,如T315I突变。T315I突变患者不仅对第一代酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼耐药,对第二代酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼(Dasatinib)和尼洛替尼(Nilotinib)也耐药。近年来,随着对白血病细胞生物学和分子生物学特性探讨的深入,发现白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)不仅是CML对分子靶向药物耐药的关键因素,而且在白血病起始和复发中也起着重要的作用,LSC是CML长期缓解和治愈的主要障碍之一。CML患者要获得长期缓解和治愈,必需清除这些白血病干细胞。由此,筛选和鉴定白血病干细胞治疗性药物靶标,阐明其作用分子机制,以及研发相应药物是目前迫切需要解决的不足之一。目前抗肿瘤药物大多有着毒副反应大,昂贵等不足,由此寻找高效低毒价廉的抗肿瘤药物和策略,提升患者存活质量已成为医学探讨的热点。汉防己甲素(tetrandrine,TTD)又名粉防己碱,是以防已科千金藤属植物粉防己(Stephamia tetrandra S. Moore)块根中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱,是一种钙调素拮抗剂,对多种肿瘤细胞株具有显著的增殖抑制作用。有文献报道钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱγ(CaMKⅡ γ)在很多肿瘤细胞中呈异常表达,探讨发现CaMKⅡγ在髓系白血病细胞中呈异常激活状态并调节白血病细胞的增殖。汉防己甲素对慢性粒细胞白血病急性变白血病细胞株K562细胞和多药耐药株K562/ADM细胞体内外均有较好的抗增殖和逆转多药耐药的作用,但其作用机制尚缺乏深入的探讨。由此,本论文以K562细胞及伊马替尼耐药的K562R细胞和慢性粒细胞白血病患者原代细胞为探讨对象,探讨钙调素拮抗剂枸橼酸汉防己甲素(Tetrandrine citrate, TTDC)体内外抗慢性粒细胞白血病作用及其可能的机制。第一部分：枸橼酸汉防己甲素抑制人慢性粒细胞白血病细胞增殖的体外探讨目的：检测枸橼酸汉防己甲素对人慢性粒细胞白血病细胞增殖抑制作用。策略：用TTDC处理慢性粒细胞白血病细胞株(K562细胞和K562R细胞)和慢性粒细胞白血病患者原代细胞,采取MTT检测处理前后对白血病细胞的增殖抑制作用,Wright-Giemsa染色观察细胞的形态的变化；流式细胞仪浅析细胞DNA含量及细胞凋亡；纤维素克隆形成试验检测TTDC对白血病细胞克隆的增殖抑制作用；运用Western Blot技术检测BCR-ABL蛋白及其磷酸化蛋白表达。结果：不同浓度(0～16μg/m1)的TTDC分别作用于K562细胞和K562R细胞24h、48h、72h能显著抑制K562细胞和K562R细胞的增殖,其作用具有浓度-时间依赖性,TTDC对K562细胞和K562R细胞在48h IC50分别是2.78μg/ml和3.51μg/ml,同样TTDC对慢性粒细胞白血病患者原代细胞也具有增殖抑制作用而对正常造血细胞没有显著抑制作用。TTDC处理K562R细胞出现凋亡细胞形态学的转变和凋亡细胞比例的增加,K562R细胞经1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml和8.0μg/mlTTDC分别处理48h后,早期凋亡细胞比例分别为3.1%,7.3%,50%和76%,呈显著递增走势,纤维素克隆形成试验结果显示TTDC能抑制CML细胞克隆形成,同时观察到经TTDC作用后P210BCR-ABL蛋白表达量显著下降。结论：TTDC能够抑制K562细胞和K562R细胞的增殖,其作用具有浓度-时间依赖性,对慢性粒细胞白血病患者原代白血病细胞增殖和克隆形成具有抑制作用而对正常外周血单个核细胞抑制作用不显著;TTDC对白血病细胞增殖抑制作用与诱导细胞凋亡和抑制CML关键性分子P2108CR-ABL蛋白的表达有关。第二部分枸橼酸汉防己甲素抑制伊马替尼耐药的K562R细胞增殖的体内探讨目的：观察枸橼酸汉防己甲素抑制伊马替尼耐药的K562R细胞移植瘤的生长及其安全性。策略：用BALB/C nu/nu裸鼠建立伊马替尼耐药的K562R细胞的异种移植瘤模型,皮下接种K562R细胞浓度为2×107/0.2ml,待肿瘤体积为50-100mm3时分成对照组和给药组,给药组伊马替尼和TTDC均口服给药剂量为100mg/kg,每日三次连续给药10天,饲养至35天。对照组给予等体积生理盐水。分别观察伊马替尼、TTDC治疗组和对照组荷瘤裸鼠的抑瘤效果及其副作用。结果：裸鼠在接种K562R细胞后第3-5天,腋下就能摸到米粒大小的瘤块,提示荷瘤裸鼠建模成功,本探讨分两批进行,实验动物共25只,成瘤率为100%,伊马替尼给药组存活率7/7(100%),其中3只荷瘤裸鼠的肿块消失,无瘤存活率为3/7(42.9%)；而对照组3只裸鼠因肿瘤负荷过大死亡,存活率3/6(50%)。至给药后35天,对照组和伊马替尼给药组存活裸鼠平均肿瘤重量分别为2.24±0.25g和1.02±1.23g,对照组大于伊马替尼组。TTDC给药组6只荷瘤裸鼠的肿瘤生长均得到抑制,其中5只肿瘤消退,1只显著缩小,存活率6/6(100%),无瘤存活率达5/6(83.33%),抑瘤率为91.60%；而对照组6只裸鼠的肿瘤均继续生长,其中一只裸鼠因肿瘤负荷过大死亡,存活率5/6(83.33%),至给药后35天,对照组和TTDC组存活的荷瘤裸鼠平均肿瘤重量分别是2.20±0.77g和0.135±0.32g,两组间差别具有统计学作用(p值0.05)。在TTDC给药期间,裸鼠一度体重低于对照组,但后又缓慢增加,裸鼠无脱发,食欲、活动能力、精神状态良好,提示TTDC对BALB/c-nu/nu裸鼠没有显著的毒副反应。结论：TTDC在裸鼠体内对伊马替尼耐药的K562R细胞的异种移植瘤具有良好的抑瘤作用,在实验期间裸鼠没有出现显著的毒副反应。第三部分枸橼酸汉防己甲素抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖机制的探讨目的：探讨枸橼酸汉防己甲素抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖的可能的机制。策略：采取Western blot技术检测CaMKⅡγ、pCaMKII γ和β-catenin蛋白的表达用流式细胞分选仪分选CD34+CD38细胞,运用基因转染技术建立CaMKⅡ γ高表达稳转细胞(转染pcDNA3.1-CaMKII y-EGFP质粒的K562细胞),运用激光共聚焦显微镜观察CaMKⅡ γ的亚细胞定位,并用流式细胞仪检测CaMKⅡ γ在细胞周期中的表达。结果：pCaMKⅡ γ激酶在5例CML急变期患者的细胞中呈高表达,同时伴有β-catenin表达水平的增高,而在6例慢性期患者的细胞中两者表达水平均较低,甚至不表达。CaMKⅡ γ激酶在CD34+CD38-的CML细胞群中呈异常激活和高表达状态,而在CD34-的CML细胞群和正常脐血CD34+CD38-细胞群中呈低表达。在高表达CaMKⅡγ的K562细胞中CaMKⅡ γ荧光信号在S/G2期达到最高,细胞周期的检测中也发现转染pcDNA3.1-CaMKII y-EGFP质粒的K562细胞在G2/M期的比例显著高于对照。经0-4μg/mlTTDC处理K562R细胞48小时后发现随着TTDC药物浓度的增加pCaMKⅡ γ蛋白表达水平显著下降,并呈现与(3-catenin蛋白表达量下降同步,而CaMKⅡ γ表达水平无显著变化。结论pCaMKⅡ γ激酶在CML急变期患者的原代细胞和CD34+CD38-的CML细胞群中呈异常高表达,并与β-catenin呈同步表达；根据CaMKⅡ γ激酶的亚细胞定位和不同细胞周期的表达量,推测其与CML细胞增殖相关；TTDC可以通过抑制磷酸化的CaMKⅡ γ激酶活性并同步下调β-catenin蛋白发挥抗白血病作用；推测CaMKⅡ γ激酶与wnt/β-catenin信号通路间可能有着相互联系。关键词：枸橼酸汉防己甲素论文慢性粒细胞白血病论文钙调素拮抗剂论文钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱγ论文伊马替尼耐药论文
致谢5-6
中文摘要6-11
Abstract11-19
缩略词表19-20
插图和附表清单20-23
目录23-26
1 绪论26-32
2 枸橼酸汉防已甲素抑制人慢性粒细胞白血病细胞增殖的体外探讨32-68
2.1 前言32-33
2.2 材料和策略33-45
2.2.1 实验材料33-39
2.2.1.1 细胞株33
2.2.1.2 主要实验设备33-35
2.2.1.3 主要试剂和配方35-39
2.2.1.3.1 主要试剂35-36
2.2.1.3.2 主要溶液配制策略36-39
2.2.2 实验策略39-45
2.2.2.1 细胞培养39
2.2.2.2 原代骨髓或外周血标本单个核细胞分离39
2.2.2.3 MTT法检测细胞增殖39-40
2.2.2.4 Wright-Giemsa染色40
2.2.2.5 Annexin V/PI荧光双染-流式细胞仪测定细胞凋亡率40-41
2.2.2.6 PI标记-流式细胞仪检测细胞DNA含量41-42
2.2.2.7 纤维素克隆形成试验42-43
2.2.2.8 Western Blot相应蛋白检测43-45
2.2.2.8.1 细胞总蛋白提取策略43
2.2.2.8.2 BCA法蛋白定量43
2.2.2.8.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、杂交、成像43-45
2.2.3 统计浅析策略45
2.3 结果45-64
2.3.1 TTDC抑制K562细胞增殖45-47
2.3.2 TTDC抑制K562R细胞增殖47-49
2.3.3 TTDC对慢性粒细胞白血病患者原代细胞的增殖抑制作用49-52
2.3.4 TTDC对正常人外周血单个核细胞生长抑制作用52-54
2.3.5 Wright-Giemsa染色观察TTDC诱导K562R细胞凋亡54-55
2.3.6 流式细胞仪检测TTDC诱导K562R细胞凋亡55-58
2.3.7 TTDC对细胞DNA含量的影响58-59
2.3.8 TTDC对细胞周期的影响59-60
2.3.9 TTDC抑制白血病细胞克隆的形成60-63
2.3.10 TTDC对BCR-ABL蛋白的影响63-64
2.4 讨论64-67
2.5 小结67-68
3 枸橼酸汉防已甲素抑制伊马替尼耐药的K562R细胞增殖的体内探讨68-81
3.1 前言68
3.2 材料与策略68-71
3.2.1 实验材料68-69
3.2.1.1 细胞株68
3.2.1.2 实验动物68-69
3.2.1.3 主要试剂与药品69
3.2.1.4 主要实验设备69
3.2.2 实验策略69-71
3.2.2.1 细胞培养69
3.2.2.2 动物实验条件69-70
3.2.2.3 实验药物配制70
3.2.2.4 荷人白血病细胞裸鼠移植瘤模型的建立70
3.2.2.5 实验分组、给药策略、剂量和给药时间70
3.2.2.6 观察指标70-71
3.2.2.7 动物处死71
3.2.2.8 数据浅析71
3.3 结果71-78
3.3.1 荷瘤裸鼠的建立71
3.3.2 伊马替尼对裸鼠体内K562R细胞异种移植瘤生长的抑制作用71-73
3.3.3 TTDC对裸鼠体内K562R细胞异种移植瘤生长的抑制作用73-78
3.4 讨论78-80
3.5 小结80-81
4 枸橼酸汉防已甲素抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖机制的初步探讨81-99
4.1 前言81-82
4.2 材料与策略82-87
4.2.1 主要材料82-85
4.2.1.1 细胞株82
4.2.1.2 主要试剂与药品82-83
4.2.1.3 主要实验设备83-84
4.2.1.4 常用缓冲液84-85
4.2.2 实验策略85-87
4.2.2.1 细胞培养85-86
4.2.2.2 CML患者骨髓及正常脐血标本单个核细胞分离86
4.2.2.3 流式细胞分选技术分选CD34~+CD38~-细胞86
4.2.2.4 细胞总蛋白提取策略86
4.2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、杂交、成像86
4.2.2.6 细胞转染86
4.2.2.7 观察转染pcDNA3.1-CaMKⅡγ-EGFP质粒的K562细胞内CaMKⅡγ的亚细胞定位86-87
4.2.2.8 PI标记-流式细胞仪检测细胞周期87
4.3 结果87-94
4.3.1 CaMKⅡγ激酶和β-catenin在慢性粒细胞白血病细胞中的表达87-88
4.3.2 CaMKⅡγ激酶在CD34~+CD38~-白血病细胞中的表达88-90
4.3.3 CaMKⅡγ在转染pcDNA3.1-CaMKⅡγ-EGFP质粒的K562细胞中的亚细胞定位90-91
4.3.4 CaMKⅡγ对转染pcDNA3.1-CaMKⅡγ-EGFP质粒的K562细胞的细胞周期的影响91-92
4.3.5 TTDC作用K562R细胞后磷酸化CaMKⅡγ(pCaMKⅡγ)的表达水平92-93
4.3.6 TTDC作用K562R细胞后β-catenin蛋白表达量变化93-94
4.4 讨论94-98
4.5 小结98-99
5 结论99-100
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