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谈述心力衰竭转化生长因子结合蛋白2做为心力衰竭标志物初步

收藏本文 2024-02-24 点赞:8202 浏览:24681 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:尽管心血管疾病的治疗策略现已取得了很大的进展,但是各种心脏疾病导致的心力衰竭在全球仍然具有很高的发病率和死亡率。心力衰竭是一种由多因素引起的疾病,内在的分子机制还不是很清楚,但很可能与潜在的基因和蛋白质表达转变有关。本探讨室前期通过对终末期心力衰竭患者心肌组织的基因组学筛选发现转化生长因子结合蛋白2(Latent TGF-β binding protein2, LTBP-2)表达显著升高(7.7倍)。LTBP-2是一种细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)糖蛋白,属于LTBPs/fibrilpns超家族,在肺、肝、脾、心脏均有表达,在胚胎发生、动脉损伤修复、细胞粘附和弹性纤维聚焦历程中发挥重要作用,由于T TRP-2其因敲除后导致受精卵不能着床而致小鼠流产,使得对它的功能探讨开展起来相对困难,其生物学功能目前还不是很明确。为了验证前期基因芯片筛选的结果,本实验检测了34例终末期心力衰竭患者心脏移植术后获得的心肌组织中LTBP-2的表达水平;检测了LTBP-2在大鼠心肌梗死不同时间点后的动态变化规律;为了进一步探讨LTBP-2在心血管疾病可能发挥的作用及其表达调控机制,预实验观察了一些与心脏疾病联系密切的因素和因子对LTBP-2的调控作用,其中转化生长因子β1(Tranorming growth factor beta1, TGF-β1)的刺激作用最为显著,而TGF-β1作为一种功能广泛的重要的细胞因子,参与心血管疾病的多种病理生理历程,包括心脏纤维化,心室重构等。我们推测LTBP-2可能通过TGF-β1对它的调控作用参与心室重构等病理生理历程,由此本实验探讨和阐明了TGF-β1推动心肌细胞LTBP-2表达的信号转导通路;LTBP-2在心脏病理状态下表达显著升高,提示它是否可做为一种生物标志物对疾病进行早期诊断和预测,由此我们入选了133例因呼吸困难入院的患者,检测了LTBP-2对低射血分数心力衰竭(heart failure with reduced ejection fraction, HFREF)患者的诊断能力,并与公认的标志物NT-proBNP进行了比较。探讨内容主要包括以下2个部分:(一) LTBP-2在终末期心力衰竭患者和心肌梗死大鼠心肌组织中的表达及TGF-β1上调LTBP-2表达的信号通路探讨。1. LTBP-2在终末期心力衰竭患者的心肌组织中表达升高。取心脏移植术后的34例终末期心力衰竭患者的左室心肌组织,其中包括19例扩张性心肌病(Dilated cardiomyopathy, DCM),8例缺血性心肌病(Ischemic cardiomyopathy, ICM)和7例致右室心律失常性心肌病(Arrythmogenic right ventricular cardiomyopathy, ARVC),以8例死于意外事故的正常人的心肌组织为对照。然后进行苏木精—伊红染色(hematoxypn-eosin staining, HE),用LTBP-2特异的抗体进行免疫组织化学浅析,采取酶联免疫吸附法(enzyme-pnked immunosorbent assay, ELISA)检测心肌组织中LTBP-2的表达情况。结果显示HE染色后在光镜下观察,与正常心脏相比,ICM和DCM的衰竭心脏有不同程度的纤维化,ARVC的衰竭心脏呈现出纤维脂肪组织或脂肪替代;免疫组织化学浅析显示LTBP-2在因ICM、DCM和ARVC的衰竭心脏呈现较强的免疫反应,而正常对照的心脏没有或只有微弱的免疫反应;ELISA进一步证明了与正常心脏相比,心肌组织的LTBP-2中位数水平显著升高(974pg/mg v.s.19g/mg, p0.001)。2. LTBP-2在心肌梗死大鼠心肌组织中表达升高。雄性SD大鼠180只随机分为两组:心肌梗死模型组和检测手术对照组。通过结扎大鼠左冠状动脉前降支制作大鼠心梗模型,梗死后1天、3天、1周、2周、4周和8周取大鼠左心室组织,HE染色观察模型建立的情况,ELISA检测大鼠心肌梗死区LTBP-2的表达变化规律。结果表明HE染色在组织学上显示随着时间推移,梗死区心肌组织逐渐坏死,取代正常心肌结构,与梗死周边区存活的心肌组织形成鲜明的比较,表明心梗造模成功;ELISA结果显示与检测手术组相比,LTBP-2表达升高,尤其以1天和1周最为显著。3. TGF-β1上调LTBP2表达的信号通路探讨。培养乳鼠心肌细胞;实时定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)、蛋白质印迹和免疫细胞化学策略检测不同时间和不同浓度的TGF-β1对大鼠乳鼠心肌细胞LTBP2基因及蛋白表达的影响;用TGF-β1相关信号通路阻断剂探讨TGF-β1调节LTBP2表达转变的信号传导机制。结果显示LTBP-2基因表达随着TGF-β1浓度增加(0、2、5、10ng/ml)而显著升高,在5ng/ml时刺激最强(p0.05);5ng/ml的TGF-β1刺激下心肌细胞内LTBP-2基因和蛋白表达的升高呈时间依赖性,均在12h最高,24h开始呈下降走势(p0.05或p0.01);免疫细胞化学结果显示TGF-β1显著升高LTBP-2的表达。信号传导通路探讨显示TGF-β1在心肌细胞内主要通过ERK信号通路和PI3K信号通路诱导LTBP-2的表达。此部分结果小结:LTBP-2在终末期心力衰竭患者和心肌梗死大鼠的心肌组织中表达升高。TGF-β1在乳鼠心肌细胞内通过ERK信号通路和PI3K信号通路上调LTBP2的表达。(二) LTBP-2对低射血分数心力衰竭患者的诊断能力评估入选了133例因呼吸困难门诊或入院的心力衰竭患者,收集患者临床和生化资料,采集外周静脉血。以来自同期行常规查体证实无心血管危险因素、超声心动图检查证实无心脏结构转变的年龄、性别匹配的健康人为正常对照组(Normal组),共87例。以左室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)≤40%为HFREF的诊断金标准,将133例患者分为HFREF组(n=67)和保守射血分数心衰(heart failure with preserved ejection fraction, HFPEF)组(n=66)两组,ELISA检测Normal组,HFPEF组和HFREF组血清LTBP-2和NT-proBNP的水平;对LTBP-2和NT-proBNP进行了两两相关性浅析,并分别对二者与LVEF的相关性进行了浅析:受试者工作特点曲线(Receiver operator characteristic curve,ROC曲线)浅析比较LTBP-2和NT-proBNP对HFREF的诊断能力,用Logistic回归浅析对二者进行了联合诊断浅析。结果显示ELISA结果衣明LTBP-2和NT-proBNP在Normal组,HFPEF组和HFREF组中的中位数水平逐渐升高,LTBP-2分别为365.8pg/ml,587.1pg/ml和857.6pg/ml(两两相比均为p0.001),NT-proBNP分别为109.1pg/ml,126.5pg/ml和229.g/ml;相关性浅析结果显不LTBP-2与NT-proBNP没有相关性(R=0.04),LTBP-2和NT-proBNP与LVEF分别都呈显著负相关(R=-0.31,p=0.001和R=-0.32,p0.001);ROC曲线浅析显示LTBP-2的曲线下面积(Area under the curve, AUC)为0.67(95%CI0.58-0.75),NT-proBNP的AUC为0.68(95%CI0.59-0.77),二者没有显著差别,Logistic回归浅析对二者进行联合诊断的AUC为0.73(95%CI0.58-0.76),与单个标志物诊断能力相比有所提升,但无统计学差别。此部分结果小结:与正常对照及HFPEF相比,HFREF组血清LTBP-2和NT-proBNP水平显著升高。LTBP-2对HFREF的诊断能力与NT-proBNP相当,二者联合诊断效果稍优于单个标志物。本探讨首次阐明了LTBP-2在终末期心力衰竭患者以及心肌梗死大鼠心肌组织中表达显著升高,明确了TGF-β1推动心肌细胞LTBP-2表达的上调作用并一定程度上阐明了心肌细胞LTBP-2表达调控的信号通路。本探讨更为重要的临床作用在于首次通过诊断试验发现LTBP-2与NT-proBNP对HFREF患者的诊断能力相当,可能是心力衰竭的一种新的生物标志物。考虑到LTBP-2是一种细胞外基质蛋白,可能通过TGF-β1等重要的因子调控参与心室重构等病理生理历程,明确其在心脏的表达情况及其在心肌细胞的信号转导通路,可以帮助我们有效地对LTBP-2的表达和分泌进行调控,以而改善甚至逆转心肌梗死和心力衰竭引起的心室重构及心脏病的预后。另外本探讨将基础探讨和临床探讨有效结合,允分体现了转化医学的理念,为利用生物标志物诊断、预测乃至治疗心力衰竭等心血管疾病提供新的靶点。心力衰竭是一种高发病率和高死亡率的综合性临床疾病。冠心病和高血压是心衰的主要病因,另外还包括原发性扩张性心肌病,心脏瓣膜病和糖尿病等疾病。在心肌损伤时很难预测能否进展为心力衰竭。心脏功能的损伤会激活代偿性的神经激素释放以而在接下来的阶段推动心衰的进程。其中肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)在心力衰竭的进程中发挥关键作用。随着RAAS的持续激活,血管紧张素Ⅱ受体在衰竭的心脏表达下调,下游细胞内分子上调激活引起心脏肥厚,肾上腺素受体在心衰患者表达下调,参与相应的病理生理历程。心力衰竭发生和预后的种族差别表明遗传因素可能参与左室重建和心力衰竭的病理生理历程。除了寻找心衰的致病基因,很多探讨表明编码神经激素,肾上腺素等基因的多态性也在调节心衰发生进展的历程中发挥重要作用,其中血管紧张素转化酶插入/缺失(angiotensin-converting enzyme insertion/deletion, ACE I/D)的多态性是探讨的一个重点。目前,有一些病例-对照探讨探讨ACE I/D多态性是否与心力衰竭相关,但由于样本少且具有异质性使得结论并不一致,仍然具有争议。在2007年一篇系统综述对ACE I/D多态性与心力衰竭的联系做了一个小的荟萃浅析,发现ACEI/D多态性与心力衰竭并没有相关性。这篇荟萃浅析有很大的局限性,它只评价了ACE I/D多态性与缺血性心力衰竭危险性的联系并只纳入了5篇病例-对照探讨。为了进一步阐明ACE I/D多态性与心力衰竭的联系,本实验以循证医学角度运用荟萃浅析,对ACE I/D多态性与不同种族的心力衰竭及不同病因导致的心力衰竭的关联性进行了详细的浅析。本实验的探讨内容如下:以"(angiotensin-converting enzyme or ACE) and (polymorphi or mutation) and(cardiovascular disease or heart failure)"为搜索关键词,系统检索了PUBMED, EmbaSE, The Cochrane Library三大数据库以及之前发表的综述和相关引用文献,选择纳入2011年6月之前发表的ACE I/D多态性与心力衰竭危险性联系的病例-对照探讨。提取的数据主要包括每篇纳入文献的第一作者,发表年份,国家,杂志,探讨人群的种族,每个基因表型的病例和对照的人数,检测基因型的策略,心力衰竭的病因(缺血性心衰还是扩张性心衰)。如果等位基因频率没有给出,通过病例和对照的基因型频率进行相关计算。ACE I/D有四个遗传模型,分别为等位基因比较模型(Dvs.Ⅰ),隐性模型(DDvs. ID/II),显性模型(DD/IDvs.Ⅱ)和加性模型(DD vs.DI)。本探讨分别浅析了四种模型下ACE I/D与心衰的关联性,并基于种族和心衰病因进行了亚组浅析。结果显示,有17个病例对照探讨符合纳入标准,一共5576个参与者,其中包括2453个病例和3123个对照。纳入的17个探讨之间具有显著的异质性(DD vs.ID/Ⅱ,P=0.02;DD/ID vs.Ⅱ,P=0.000and D vs.Ⅰ,P=0.01)。对四种遗传模型的浅析显示ACE I/D与心力衰竭的危险性没有显著关联。病因亚组浅析显示ACE I/D与缺血性心力衰竭和扩张性心肌病导致的心力衰竭均没有相关性。种族亚组浅析显示ACE I/D与不同种族的心力衰竭同样没有相关性。结果小结:本实验通过荟萃浅析表明ACE I/D多态性与心力衰竭没有显著的关联。这需要大型的前瞻性的病例对照探讨进一步验证。将来的探讨应该以基因-基因和基因-环境的相互作用出发进一步阐明心力衰竭的遗传背景。关键词:转化生长因子结合蛋白2论文心肌细胞论文心力衰竭论文低射血分数心力衰竭论文保守射血分数心力衰竭论文信号转导通路论文生物标志物论文心力衰竭论文血管紧张素转换酶论文多态性论文荟萃浅析论文

    第一部分 转化生长因子结合蛋白2做为心力衰竭标志物的探讨4-62

    中文摘要4-8

    Abstract8-12

    前言12-16

    (一) LTBP-2在终末期心力衰竭患者和心肌梗死大鼠的表达及TGF-β1上调LTBP-2表达的信号通路探讨16-42

    材料与策略16-34

    实验结果34-42

    (二) LTBP-2对低射血分数心力衰竭患者的诊断能力评估42-52

    材料与策略42-47

    实验结果47-52

    讨论52-56

    结论56-57

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