摘要：本博士学位论文的主要贡献在于：针对生物医学快速检测中所面对的三大缺陷——成本高、浅析时间长、检测灵敏度低,开创性的设计制作了以高分子聚合物PDMS芯片为浅析平台,通过有效的修饰策略对微流控芯片通道表面进行修饰和改性,成功实现了微流控芯片通道内生物分子的固定,为生物医学中重大不足的快速检测提供了新的策略,实现了对环境藻毒素的高灵敏度检测,为现场运用提供了基础；并且,成功的对疟疾病实现了临床检测,具有快速、灵敏、高效等优点；完成了对肝癌CTC的快速高效检测,为肝癌的个性化治疗提供可靠的指导。过去的二十年,是微流控技术进展的二十年。以Manz和Widmer等人1990年首次提出微型全浅析系统(Miniaturized Total Analysis System, μTAS)的概念,到2002年Quake等以“微流控芯片大规模集成”为题在Science上发表文章,微流控技术作为当前浅析科学的重要进展前沿,在探讨方面取得了飞速的进展。浅析检测技术手段的逐步微型化,以及现场“即时检测”的提出对浅析技术提出更高的要求。由此进展针对生物医学中实际重大不足的微流控快速检测系统是微流控芯片探讨与运用的重要方面。首先,环境中有毒物质的快速检测是目前快速检测领域的重点和难点之一。随着有害水藻的爆发,会产生大量的有害藻类毒素。这些毒素通过食物链,进入鱼类、贝类体内,人食用了污染的鱼类、贝类会引发食物中毒,甚至威胁生命健康。国内外现行的藻类毒素检测技术主要包括：生物检测法,化学检测法,细胞毒性检测技术,放射性标定法,以及免疫检测等。其中,生物检测法主要采取喂食小鼠、家蝇等毒素的策略,缺点是周期长,费用高,重复性差,而且需要专门培训的人员来操作。化学检测法,主要通过高效液相色谱,毛细管电泳,色谱质谱联用策略,重现性好,但设备功能单一,体积大和昂贵,便携性、选择性差。细胞毒性检测技术,直观策略来观察加入毒素后,细胞的反应来判断毒素种类,灵敏度高,但只能做定性测量,不能测定浓度而且需要良好的细胞培养技术。放射性标定法仪器昂贵,测试费用高,并且适用毒素检测范围窄。免疫检测技术主要利用抗原和抗体专一、特异结合的特点对毒素进行定性,定量检测,现主要有直接竞争检测法,间接法,“三明治”法。这种策略专一性强,灵敏度高,是非常有潜力的一种策略,但操作比较繁琐,商业化试剂盒昂贵,主要为手工操作,自动化程度低而且需要专业人员。其次,针对重大传染病的临床快速诊断是微流控芯片在运用探讨的重要方面。近年来,由于疟原虫对药物、传播媒介对杀虫剂抗性的迅速进展,疟疾快速的诊断对制约全球疟疾的作用显得更加重要。迄今为止,显微镜镜检(厚血膜、薄血膜)仍是疟疾诊断的金标准。但是显微镜镜检作为一种诊断策略又有着一些不足,由于疟原虫形体小,形态相似,难以染色和检出,需要有经验的人员才能做到正确的诊断。疟疾流行区由于熟练镜检技术人员及设备缺乏,仅依靠传统厚薄血膜镜检法已越来越不能适应当前疟疾诊断的需要随着免疫学技术的进展,间接荧光抗体和ELISA均很快在疟疾诊断中得到运用,但是此类策略抗体用量相对较大,成本较高。而且,反应时间长,不能满足快速诊断的要求。PCR技术显示了较高的敏感性和特异性可以对疟原虫的感染做出早期快速诊断。但需要更复杂的仪器设备和技术条件作为支持,不适合作为疟疾流行区常规的检测手段,难以在基层推广运用。最后,针对肝癌循环肿瘤细胞的高灵敏度捕获受到现有技术的制约。采取反转录聚合酶链式反检测HCC患者外周血中甲胎蛋白mRNA以而检测HCC患者CTCs的报道较多。然而,RT-PCR法有其固有局限,如易产生检测阳性和检测阴性、操作难以标准化、不能准确估算样本中CTC的数目等。此外,更不可忽略的是,RT-PCR法须破坏细胞形态,不能对单个CTC进行观察、浅析和计数,而这些数据可提供CTCs恶性程度和侵袭性方面的信息。由此迫切需要建立特异和敏感的循环肝癌细胞分离和检测技术。目前分离CTCs的标准策略是基于肿瘤细胞表面上皮性抗原的磁性激活细胞分选技术(magnetic-activated cell separation, MACS)。由于缺乏针对肝癌细胞表面特异性抗原的单克隆抗体,迄今鲜见MACS用于分离循环肝癌细胞的报道。尽管肝癌细胞属于上皮性细胞,但EpCAM仅在约35%左右的HCC组织标本中表达。由此,现有系统并不适合用于高通量、高灵敏度分离与检测循环肝癌细胞。针对以上快速检测领域所面对的三大不足,本博士学位论文分为五章节开展探讨中作。各章节主要内容如下：第一章是绪论部分。本章主要讨论微流控芯片的进展概况,生物医学浅析领域的进展近况和遇到的挑战,以及微流控芯片技术在生物医学浅析方面的运用进展。以而引出本论文工作的探讨方向,为设计进展微流控芯片在生物医学浅析快速检测领域运用的新策略探讨提出论述依据和实际作用。第二章主要介绍集成化微流控免疫芯片系统用于环境藻类毒素的高灵敏度快速检测浅析新策略探讨。我们探讨建立了用于对代表性藻类毒素微囊藻毒素(microcystins, MCs),石房蛤毒索(Saxitoxin, STX)与柱孢藻毒素(cypndrospermopsin, CNY)三种藻类毒素的现场快速检测微流控芯片。可以对实际样品(水样和鱼类、贝类等食物样品)溶液中MC, STX与CNY进行快速检测的微流控芯片。实验建立了用于对代表性藻类毒素微囊藻类毒素的现场快速检测微流控芯片。芯片包含七个可以同时制约,也可独立操作的免疫亲和反应柱,可以对实际样品(水样和鱼类、贝类等食物样品)溶液中微囊藻毒素进行快速检测的微流控芯片。检测限为0.02ng/ml。实现对多个样品快速,平行的检测。第三章主要介绍基于抗体检测的微流控芯片用于疟疾快速临床检测的新策略探讨。我们探讨了针对在条件欠发达地区多发的传染性疾病疟疾(Malaria)其临床快速现场诊断,提出可行的案例。建立了基于间接免疫荧光反应原理的快速检测微流控芯片用于疟疾病(Malaria)的临床诊断探讨。实验中通过检验病人血清样品中的MSP1-19与PfF2抗体的检测,实现了疟疾临床快速诊断,免疫反应中得到的不同荧光强度,可以被信号采集模块采集浅析,以而提供临床诊断信息。在同一块芯片实现双抗原同时检测。实验证明,微流控芯片免疫系统可以得到可靠的检测结果,并且极大的节约了抗体用量,缩短了反应所需时间,使得检测成本极大的降低。结果指示,探讨中采取MSP1-19与PfF2双抗原检测的策略,对疟疾进行快速检测可以提供相对更加可靠的诊断结果。结果显示,探讨建立的微流控芯片免疫系统与策略可以有效的用于基于抗体的疟疾血清学检测,为条件欠发达地区的疾病现场检测,实现疾病有效制约提供可行案例。第四章主要介绍肝癌循环肿瘤细胞(CTC)的微流控芯片分离检测系统新策略探讨。我们在实验中建立了一种具有高度特异性和敏感性的肝癌循环肿瘤细胞分离与检测系统。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者体内的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs),即循环肝癌细胞,是HCC转移和复发的根源。检测循环肝癌细胞对于预测HCC转移复发无疑具有重要临床作用。探讨中建立了一种独特的基于ASGPR及其配体相互作用的循环肝癌细胞微流控芯片分选策略,结合基于肝细胞特异性抗体Hep Par1的免疫荧光染色鉴定,进展了一种新的循环肝癌细胞分离与检测系统。实验中用标准细胞加入全血,测定了系统工作的最佳条件。实验证明系统具有很好的特异性和敏感性,且操作方便,易于标准化。分离到的CTCs可进行免疫形态学鉴定和计数。并初步显示了该系统用于临床检测的可行性。第五章主要介绍高密度结构PDMS芯片制作技术探讨。我们讨论了对微流控芯片的制作软光刻技术提出改善,以而得到稳定重复的微结构。为具有高密度阵列微结构的PDMS芯片制作,提供可靠的策略。针对聚合物材料PDMS芯片在复制模塑成型历程中出现的缺陷不足进行了探讨,设计了含有50μm高的不同密度微柱阵列芯片。运用实验提出的案例,成功实现了其复制成型,并且保证了模板的多次重复利用。其最低密度共含有14,400个微柱(40mm×18mm),最高密度含有39,760个微柱(40mm×18mm),其对应的最大结构密度为5×104/cm2。本探讨为简化复杂PDMS芯片制作处理,提出一步涂层/一步灌注的策略,实现简易操作提供了依据。该探讨得出了PDMS芯片制作的具体工艺条件,并进行优化,获得了完整的加工技术案例。关键词：微流控芯片论文免疫反应论文环境监测论文藻类毒素论文微囊藻毒素论文石房蛤毒索论文柱孢藻毒素论文疟疾论文临床诊断论文肝癌论文循环肿瘤细胞论文去唾液酸糖蛋白论文唾液酸糖蛋白受体论文聚二硅氧烷论文软光刻论文快速检测论文
目录4-7
摘要7-11
ABSTRACT11-15
第一章 绪论15-43
内容摘要15-16
1.1 微流控技术进展概况16-28
1.1.1 微流控技术(Microfluidics)的基本概念17
1.1.2 微流控芯片的材料17-18
1.1.3 微流控芯片的制作18
1.1.4 微流控芯片的常用技术18-23
1.1.5 微流控芯片的检测系统23-26
1.1.6 微流控浅析系统的特点26-27
1.1.7 微流控芯片的运用领域27-28
1.2 微流控芯片技术在生物医学浅析检测中的运用28-35
1.2.1 生物医学浅析检测的常规策略28
1.2.2 生物医学浅析检测的技术挑战28-29
1.2.3 微流控芯片技术在生物医学浅析运用的前景29-35
1.3 本论文的选题作用和革新性35-36
1.4 参考文献36-43
第二章 集成化微流控免疫芯片系统用于环境藻类毒素的高灵敏度快速检测浅析新策略探讨43-64
内容摘要43-44
2.1 探讨背景44-47
2.2 实验部分47-52
2.2.1 试剂与仪器47
2.2.2 双层PDMS芯片制作47-49
2.2.3 功能化微流控芯片制备49-50
2.2.4 微流控免疫芯片系统建立50
2.2.5 微流控芯片免疫反应50-51
2.2.6 藻类毒素的芯片光学检测以及数据处理51-52
2.3 结果与讨论52-59
2.3.1 多通道微流控芯片的设计52-53
2.3.2 藻类毒素芯片免疫检测条件优化53-54
2.3.3 微流控免疫芯片的藻类毒素检测54-56
2.3.4 PDMS芯片的非特异性吸附效果56-57
2.3.5 最佳抗体的浓度的确定57
2.3.6 微流控芯片系统对藻类毒素浅析的检测限与稳定性57-59
2.4 结论与展望59-60
2.5 参考文献60-64
第三章 基于抗体检测的微流控芯片用于疟疾快速临床检测的新策略探讨64-86
内容摘要64-65
3.1 探讨背景65-68
3.2 实验部分68-74
3.2.1 试剂与仪器68
3.2.2 重组蛋白MSP1-19与PfF2制备68-69
3.2.3 功能化Protein A-(anti-his)IgG微珠制备69-70
3.2.4 微流控免疫芯片系统建立70-72
3.2.5 疟疾病人血清样本处理72
3.2.6 实际疟疾病临床芯片免疫检测72-73
3.2.7 数据处理73-74
3.3 结果与讨论74-79
3.3.1 便携化微流控芯片设计74
3.3.2 不同结合抗体浓度对芯片免疫反应的效果74-75
3.3.3 不同反应时间对芯片抗原-抗体反应的效果75
3.3.4 芯片检测结果与常规ELISA检测结果比较75-78
3.3.5 芯片检测的重现性和芯片的利用寿命78-79
3.4 结论与展望79-80
3.5 参考文献80-84
附录84-86
第四章 肝癌循环肿瘤细胞(CTC)的微流控芯片分离检测系统新策略探讨86-108
内容摘要86-87
4.1 探讨背景87-90
4.2 实验部分90-95
4.2.1 试剂与仪器90
4.2.2 细胞培养90-91
4.2.3 微流控芯片的制作及通道的表而修饰91-92
4.2.4 微流控芯片检测系统建立92-93
4.2.5 标准细胞-全血的芯片捕获93
4.2.6 实际肝癌样本CTC的微流控芯片分离检测93
4.2.7 免疫荧光染色鉴定肝癌CTC及数据处理93-95
4.3 结果与讨论95-102
4.3.1 微流控芯片设计与表面修饰表征95
4.3.2 微流控细胞捕获芯片结构优化95-97
4.3.3 芯片对CTC捕获的回收率浅析97-98
4.3.4 芯片对肝癌CTC捕获的特异性98-99
4.3.5 实际肝癌样本CTC的芯片捕获效果99-102
4.4 结论与展望102-103
4.5 参考文献103-108
第五章 高密度结构PDMS芯片制作技术探讨108-124
内容摘要108-109
5.1 探讨背景109-112
5.2 实验部分112-115
5.2.1试剂与仪器112
5.2.2 微柱阵列结构芯片设计112
5.2.3 光刻法硅片模板制作112-114
5.2.4 单层PDMS微流控芯片制作114-115
5.3 结果与讨论115-120
5.3.1 光刻法硅片模板制作115-116
5.3.2 微结构阵列PDMS芯片制作116-117
5.3.3 PDMS芯片封合117
5.3.4 微结构阵列PDMS芯片表征117-120
5.4 结论与展望120-121
5.5 参考文献121-124
第六章 全文总结以及下一步工作计划124-126
6.1 全文总结124-125
6.2 工作展望125-126
博士学位攻读期间学术发表情况126-128
致谢128-130
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