大鼠SNP遗传检测技术

摘要：近年来,分子生物学技术的发展,实验动物遗传检测方法不断改进和提高,从蛋白到基因组序列,从宏观到微观,以达到准确、、高通量的检测要求。,国内外对近交系小鼠SNP遗传检测的研究较多,而对大鼠SNP遗传标记的研究较少,尤其是主要组织相容性复合体(RT1)上SNP遗传标记的研究尚未见报道。主要组织相容性复合体(RT1)是决定近交系大鼠免疫遗传品质最主要的基因群,也是遗传学检测的一个研究领域。本论文以大鼠RT1复合物基因组中具有多态性的单个核苷酸(SNP)为研究对象,利用分子生物学技术,建立了三种SNP遗传检测方法,为实验大鼠的遗传质量控制新的遗传检测手段。本研究分为三个。是建立大鼠SNP测序分型遗传检测方法。比对NCBI Nucleiotide数据库,查询BN与F344近交系大鼠多态性高的区域即RT1区序列,选定多态性信息丰富的5个区域(A区、B区、C区、D区、E区),以国内7种近交系大鼠(BN、F344、WKY、LEW、SHR、MIJ和HFJ)为模板扩增,目的片段经测序后序列比对,结果共10个SNP多态性位点,即A区序列545位(A/G);B区序列279位(T/C)、548位(A/C);C区序列207位(C/T)、356位(T/C)、386位(C/T);D区序列192位(A/G);E区序列135位(C/T)、425位(A/G)、683位(A存在/缺失)。其中5个SNP位点已在NCBI SNP数据库中公布且RS号。3个区域(B区、C区、E区)的多态性信息丰富,每300bp包含1个SNP位点。不同品系大鼠在这5个区域上拥有不同的基因型,建立SNP测序的遗传检测方法,对常用近交系大鼠和新培育品系鉴定。是建立大鼠SNP荧光定量PCR遗传检测方法。在大鼠RT1区选择9个的SNP位点(RS13458024、RS13457316、RS13456231、RS8159611、RS8149053、RS8156941、RS8166089、RS8160925、RS13448591),并设计相应的Taqman MGB探针。制备每个SNP位点不同基因型的质粒对照品,以验证探针的特异性。结果,2个Taqman MGB探针(RS13457316、RS8156941)荧光扩增信号不强并准确判定SNP位点的基因型,检测效果较差;7个探针准确判定对照品的基因型,特异性强。使用这7个探针鉴别国内常用大鼠品系(BN、F344、WKY、LEW、SHR)和新培育品系(MIJ、HFJ)的基因型。实验中对于鉴别LEW/WKY、MIJ/HFJ亲缘关系较近的品系,仍在研究中扩大检测的SNP位点数目区分。是建立高保真酶特异性SNP遗传检测方法。在单管双向等位基因特异性PCR中引入高保真酶的校正机制和硫代磷酸化修饰引物的抗外切酶作用,建立高保真酶特异性SNP检测方法。在RT1区177个SNP位点中选择多态性信息含量丰富的12个SNP为遗传检测位点(RS13458024、RS13457316、RS13456231、RS8159611、RS8149053、RS8156941、RS8166089、RS8160925、RS13448591、RS13451966、RS8158177、RS13458074),经实验优化后9个SNP位点的高保真酶检测体系。该体系对国内5种大鼠近交系(BN、F344、WKY、LEW、SHR)和2种新培育品系(MIJ和HFJ)基因型检测和品系间鉴定,其基因型结果均经测序验证,证实方法的特异性和可靠性。其次,使用该方法对国内培育的30只SD大鼠遗传检测。在9个SNP位点上,其中4个位点在SD群体中完全纯合,在RS13448591(A/G)、RS13458024(A/G)、RS13458074(T/C)、RS13457316(A/G)、RS13456231(T/C)这5个位点上出现杂合型,群体统计学分析结果,杂合子基因型频率观察值依次为0.1667,0.4333,0.4667,0.2667,0.1000,期望杂合度Nei(1973)依次为0.1528,0.4061,0.4444,0.2778,0.0950,遗传多样性Shannon指数(I)依次为0.2868,0.5961,0.6365,0.4506,0.1985,对这5个多态性位点的群体基因型X2检验,其P值均大于0.05,该群体Hardy-Weinberg平衡,样本具有代表性。本研究中,以SNP为遗传标记,分别使用测序技术、荧光定量PCR技术及高保真酶特异性检测技术,建立三种不同的SNP遗传标记的检测体系,并把这些方法应用于近交系大鼠常用品系和新培育品系的遗传检测中。还对封闭群大鼠的SNP位点的基因型研究,对其基因频率、基因型频率及杂合性了探讨。这些研究不仅为近交大鼠品系间的鉴定了实验依据,还为近交系和封闭群大鼠的遗传检测了新技术。本研究对提高我国实验动物遗传检测技术,促进生命科学发展具有。关键词：单个核苷酸多态性论文遗传检测论文荧光定量PCR论文RT1复合体论文高保真酶特异性检测论文

一、中文摘要3-5

二、英文摘要5-7

三、前言7-10

四、正文10-74

大鼠SNP 测序分型遗传检测方法的建立10-29

（一） 实验10-12

（二） 实验方法12-16

（三） 实验结果16-25

（四） 分析与讨论25-27

（五） 小结27-29

大鼠SNP 荧光定量PCR 遗传检测方法的建立29-47

（一） 实验29-31

（二） 实验方法31-38

（三） 实验结果38-44

（四） 分析与讨论44-46

（五） 小结46-47

大鼠SNP 高保真酶特异性遗传检测方法的建立47-72

（一） 实验47-49

（二） 实验方法49-54

（三） 实验结果54-67

（四） 分析与讨论67-71

（五） 小结71-72

实验总结72-74

五、参考文献74-76

六、缩略语索引76-77

七、文献综述77-85