玉米转录因子ABP9在转基因拟南芥逆境应答中功能

摘要：我国的干旱和半干旱耕地为5.7亿亩,占全国耕地面积的38%,另外还有5.54亿亩的盐渍化土地。低温冷害也严重限制着我国早春作物的种植和晚秋作物的收获。干旱、盐渍和低温等诸多非生物逆境已对作物危害最为严重的自然灾害。因此,理解非生物逆境信号在植物体内的传导途径和非生物逆境响应基因表达的调控机制以及基因工程手段提高植物的抗逆性在理论上和生产上具有的理论和实践。氧化逆境是干旱、盐渍、低温等非生物逆境危害植物的共同机制。在干旱、高盐、低温等逆境条件下植物体内ABA(Abscisic Acid)含量的升高,或间接的诱导大量活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的产生,造成植物体内氧化逆境的形成。ROS本身化学性质十分活泼,对植物具有严重的伤害作用。为了降低伤害,植物体在长期的进化中形成了酶促与非酶促等抗氧化系统。但是逆境条件下植物抗氧化系统受诱导的能力不足,导致抗性提高幅度有限。因此,要提高植物抗逆性提高植物的抗氧化逆境的能力。作为植物内源抗氧化系统的一,玉米Cat1(Catalase1)基因对于清除体内过量ROS具有不可或缺的作用。本实验室的研究Cat1基因受ABA调控,已经鉴定了Cat1基因启动子应答ABA信号的顺式元件ABRE(ABA Responsive Element)并克隆了与之特异性的转录因子ABP9(ABRE Binding Protein 9)。抗非生物逆境基因的启动子区都含有ABRE顺式作用元件,因此,本研究的目的是以模式植物拟南芥菜为系统,转基因手段分析ABP9所调控一系列ABA逆境基因及抗氧化逆境基因的表达情况,鉴定ABP9在植物ABA和ROS信号转导反应中的功能。本论文的研究工作及的主要结果如下:1.将本实验室分离的反式因子ABP9构建成表达载体:植物稳定转化表达载体pBI121-35Sp-ABP9-NOSter和pCHF3-35Sp-ABP9Dominant Negative- NOSter;2.以模式植物拟南芥为,真空渗透转化法转ABP9和ABP9DN基因植株,分别62棵和41棵转化植株,T1代植株的PCR检测阳性率为75.8%和82.9%。3.以PCR阳性的转ABP9基因植株T3单株5#为,对ABP9基因及一系列ABA基因的表达情况RT-PCR检测。结果,ABP9在5P2、5P3中均有表达,其中5P3表达最强;同时实验证明:野生型作对照,ABP9下调ABA合成基因nced3、aba1的表达,而ABA调节基因abi1被下调。4.对转基因拟南芥ABA应答的调控分析,结果:过表达ABP9改变了拟南芥中ABA基因的表达,降低转基因拟南芥内源ABA含量,平均降幅为30%~40%。却增强了转基因拟南芥萌发,根伸长和苗的发育对ABA的敏感性。这ABP9基因调控了拟南芥ABA信号途径的应答。5.对转基因拟南芥活性氧含量的分析结果,转ABP9基因的拟南芥ROS含量均比对照的ROS含量低,平均降低78.9%~57.7%。转ABP9基因在一定上起到了清除植物体内源活性氧的作用。这些结果ABP9是一个联系植物ROS和ABA信号途径的bZIP类转录因子,可能在调控植物ABA和ROS信号途径作用中发挥作用。6.对转基因过表达拟南芥分析,结果ABP9在转基因拟南芥生长发育中起着的作用。综上所述,本论文的研究工作转基因手段,证明了转录因子ABP9对拟南芥ABA和ROS信号转导途径具有调控作用,为提高植物抗非生物逆境能力的基因工程了优良基因源。关键词：ABA信号转导论文ROS活性氧论文转录因子论文ABRE论文ABP9论文

摘要3-5

Abstract5-9

1 前言9-27

1.1 植物对非生物逆境的反应9-10

1.2 活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)10-16

1.2.1 活性氧的产生部位11

1.2.2 活性氧在植物体内的作用11-15

1.2.3 植物体内活性氧清除系统15-16

1.3 脱落酸（Abscisic acid，ABA）16-23

1.3.1 ABA 的功能16-17

1.3.2 ABA 的生物合成调控17-18

1.3.3 ABA 应答基因18-19

1.3.4 依赖于ABA 途径中的顺式作用元件与反式作用因子19-20

1.3.5 ABA 与逆境信号传导20-23

1.4 利用转基因策略改变植物的抗逆性23-24

1.5 研究背景及24-26

1.6 实验设计26-27

2 与方法27-44

2.1 27-28

2.1.1 植物27

2.1.2 菌种27

2.1.3 载体27

2.1.4 工具酶和修饰酶27

2.1.5 化学试剂27

2.1.6 试剂盒27-28

2.1.7 分子量标准28

2.1.8 引物28

2.1.9 测序28

2.1.10 基因芯片分析28

2.2 方法28-44

2.2.1 质粒DNA 的小量制备(碱裂解法)28-29

2.2.2 从琼脂糖凝胶中回收DNA 片段29

2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化(电击法)29-30

2.2.4 植物稳定表达载体p81121ABP9 和pCHF3ABP9DN 的建构30-31

2.2.5 农杆菌3101 电击感受态细胞的制备和农杆菌转化及检测31-33

2.2.6 拟南芥转化及纯系筛选33-35

2.2.7 拟南芥植物的种植与处理35-36

2.2.8 植物总RNA 的提取36-37

2.2.9 基因芯片分析37

2.2.10 RT—PCR37-38

2.2.11 转基因拟南芥生理指标测定38-41

2.2.12 活性氧(ROS)含量的测定方法41-44

3 结果与分析44-64

3.1 植物转化表达载体的建构44-45

3.2 农杆菌转化45-46

3.3 拟南芥转化46-47

3.4 植物体内总RNA 的分离47-48

3.5 ABP9 转基因拟南芥纯系植株基因芯片分析48-55

3.5.1 与激素（脱落酸、赤霉素、乙烯、生长素等）的基因48-50

3.5.2 与清除活性氧的基因50-51

3.5.3 与 MYB、WRKY 和zinc finger 蛋白等转录因子的基因51-55

3.6 ABP9 转基因拟南芥纯系植株RT-PCR 分析55-57

3.6.1 拟南芥 Acti112 基因对反转录产物（模板）均一化55-56

3.6.2 ABP9 对ABA 基因的调控56-57

3.7 ABP9 对拟南芥ABA 应答的调控57-60

3.7.1 ABA 处理对转基因植株与野生型萌发率、根伸长和气孔开度的影响57-59

3.7.2 间接酶联免疫法（ELISA）测定植物内源ABA 含量59-60

3.8 ABP9 转基因植株对体内活性氧（ROS）的影响60-63

3.8.1 电子自旋共振(electron spin resonance, ESR)检测自由基含量60-61

3.8.2 H_2DCF-DA 荧光标记保卫细胞中ROS 含量61-62

3.8.3 组织化学定位法测定叶片内ROS 含量62-63

3.9 ABP9 基因对植物生长发育的影响63-64

4 和讨论64-68

4.1 64

4.2 讨论64-66

4.3 结束语66-68