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摘要：目的:食管癌是消化系统一种常见的恶性肿瘤,占恶性肿瘤的2%,我国是食管癌的高发区,因食管癌死亡者仅次于胃癌而居位,但是其发生机制尚未完全清楚。肿瘤的发生是一个长期的并且是多因素,多的复杂,包括细胞的增殖和分化、细胞的凋亡、细胞的粘附、规避机体免疫系统、新生血管的形成和肿瘤的浸润、转移等。Galectin-3蛋白作为半乳凝集素家族的一员,研究其广泛表达于正常组织和肿瘤组织,与肿瘤的发生、发展、转移和侵袭密切的关系。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种核酸序列特异性阻止基因功能的工具,能高效并且特异抑制基因的表达。有研究发现用RNAi技术阻止肿瘤基因的表达可以地抑制肿瘤细胞的增殖。本实验设计合成Galectin-3蛋白特异性的小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)表达载体,然后Galectin-3 -siRNA干扰技术作用于食管癌细胞系Eca-109,从而来研究干扰前后Galectin-3、CycpnD1蛋白表达及细胞增殖和细胞周期的改变,探求Galectin-3蛋白对食道癌细胞系Eca-109细胞增殖和细胞周期的影响以及与CycpnD1之间的关系,从而为食管癌的发生机制实验研究,为食管癌的临床治疗有价值的参考指标。方法:食管癌细胞系Eca-109为研究对象,设计合成Galectin-3的特异性siRNA并转染进食管癌Eca-109细胞。将实验分为转染组、空白对照组、阳性对照组、阴性对照组。MTT法检测各组食管癌细胞系Eca-109增殖情况,以检测的光密度值(OD值)代表各组的增殖情况,并计算各组的抑制率;免疫细胞化学方法检测实验各组食管癌细胞系Eca-109中Galectin-3、CycpnD1蛋白的表达,HIPAS-2000型计算机图像采集系统,在×200倍视野中采集图像,用Imageproplus5.0(IPP)测定阳性细胞的累积光密度值IOD,每张切片选5个视野并求其均值。应用流式细胞仪检测各组食管癌细胞系Eca-109的细胞周期变化,所得结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。数据方差分析和双变量的性分析统计学分析,以p0.05表示差异有统计学。结果:1.转染效率的检测:应用FAM标记的Negative siRNA转染食管癌细胞Eca-109 6h后用流式细胞仪检测转染效率,转染效率为69.60%。2.应用倒置相差显微镜细胞学观察,Galectin-3-siRNA转染后48h后细胞形态变化,转染组细胞与阴性对照组和空白对照组细胞相比细胞体积变小并趋向于均一,多数细胞由梭形趋向变圆,核浆比变小,瘤巨细胞减少,与空白对照组相比较细胞生长,细胞死亡并脱落。3.MTT检测结果:Galectin-3-siRNA转染进细胞48h以后,抑制了食管癌细胞系Eca-109的生长,转染组中各组与阳性对照组490nm波长处吸光度值分别为0.63±0.13、0.58±0.19、0.76±0.09、0.77±0.18,小于空白对照组(1.43±0.12)和阴性对照组(1.65±0.14),转染组、阳性对照组与空白对照组和阴性对照组相比较,差异均有统计学(p0.05),转染各组细胞抑制率分别为55.85%、59.71%、46.17%。4.免疫细胞化学检测结果:应用Galectin-3-siRNA转染食管癌细胞系Eca-109后48h Galectin-3蛋白表达降低,免疫细胞化学染色变浅,应用IPP图像分析系统检测转染组中各组的IOD值分别为20.45±0.15、20.33±0.24、20.36±0.22,空白对照组IOD值为58.15±0.22,阴性对照组IOD值为57.65±0.43,阳性对照组IOD值为19.85±0.67;转染组、阳性对照组与空白对照组和阴性对照组相比较,差异均有统计学(p0.05)。应用Galectin-3-siRNA转染食管癌细胞系Eca-109后48h CycpnD1蛋白表达降低,免疫细胞化学染色变浅,转染组中各组的IOD值分别为39.98±0.05、39.53±0.82、40.86±0.85,空白对照组IOD值为61.83±0.53,阴性对照组IOD值为62.28±0.57,阳性对照组IOD值为40.42±0.60;转染组、阳性对照组与空白对照组和阴性对照组相比较,差异均有统计学(p0.05)。免疫细胞化学结果以IOD作为半定量分析数据,转染后48h转染各组和阳性对照组Galectin-3蛋白和CycpnD1蛋白的IOD值均降低,统计学性分析Galectin-3蛋白和CycpnD1蛋白存在性(r=0.806,p=0.000),Galectin-3蛋白的表达减少,CycpnD1蛋白也相应的降低。5.流式细胞仪检测结果:Galectin-3-siRNA转染食管癌细胞系Eca-109 48h后,转染组、阳性对照组的G1期细胞数百分比较空白对照组和阴性对照组升高,S期细胞数百分比较空白对照组和阴性对照组则减少。转染组、阳性对照组的G1期细胞百分比数分别为65.76±0.45、66.42±0.17、65.10±0.67、65.44±0.42,阴性对照组和空白对照组G1期细胞数分别为36.76±0.15、35.63±0.36,转染组、阳性对照组与空白对照组和阴性对照组相比较,差异均有统计学(p0.05)。转染组、阳性对照组的S期细胞数百分比分别为23.13±1.34、23.19±1.28、24.40±2.17、24.32±1.73,阴性对照组和空白对照组S期细胞数分别为46.79±0.76、45.33±0.72,转染组、阳性对照组与空白对照组和阴性对照组相比较,差异均有统计学(p0.05)。:将设计合成的Galectin-3的特异性siRNA转染进食管癌细胞系Eca-109 48h后,肿瘤细胞的生长受到抑制,降低了食管癌细胞系Eca-109中Galectin-3蛋白和Cycpn D1蛋白的表达,使细胞生长阻滞在G1期,转染组G1期细胞数高于非转染组和阴性对照组。Galectin-3在食管癌细胞系Eca-109增殖调控中与Cycpn D1蛋白的表达密切,而共同发挥作用,应用RNAi技术阻止肿瘤基因的表达可以地抑制肿瘤细胞的生长,有可能为肿瘤的诊断与治疗了一种新的手段。关键词：Galectin-3论文Cycpn论文D1论文RNA干扰论文细胞周期调控论文
摘要4-7
Abstract7-11
英文缩写11-12
前言12-15
与方法15-22
结果22-26
讨论26-33
小结33-34
不足与展望34-35