您的位置: turnitin查重官网> 下载中心 >抗炎抗凝双效融合蛋白TAPSSL5功能

抗炎抗凝双效融合蛋白TAPSSL5功能

收藏本文 2024-03-14 点赞:15934 浏览:69859 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:研究背景及目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一个慢性炎症,炎症反应在动脉粥样硬化病变的发生、发展中起着关键作用;凝血系统以及血小板的激活也参与其中,促进了动脉粥样硬化及其血栓并发症的发生和发展。本研究将一种能与粒细胞表面P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein pgand-1,PSGL-1),并具有抑制“粒细胞-内皮细胞”黏附的蛋白质SSL5 (staphylococcal superantigen-pke protein-5,金葡萄球菌超抗原样蛋白-5),做为引导兼功能分子,与具有抑制凝血因子Xa(factor Xa , FXa)活性的分子―蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide, TAP)融合,制备出重组融合蛋白TAP-SSL5。融合使SSL5的抗炎症作用和TAP的抗凝作用相,以期为动脉粥样硬化及其血栓并发症的防治新的方法。研究方法1、PCR技术SSL5、TAP基因并克隆入pET32a表达载体,同时全基因合成技术合成重组融合蛋白TAP-SSL5的基因,并克隆入及pET22b表达载体,再转染于大肠杆菌BL21(DE3)表达,应用离子交换层析或金属离子亲和层析技术分离和纯化。2、体外实验:以流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5在人粒细胞表面的情况,及其对小鼠抗人PSGL-1抗体(KPL-1-PE)与粒细胞的竞争性抑制作用;以calcein-AM标记中性粒细胞或HL60细胞,检测TAP-SSL5对所标记细胞在P-选择素(P-selectin)包被表面黏附的影响; FXa活性抑制实验底物显色法,以S2765为底物,检测TAP-SSL5对FXa活性的抑制作用;同时以蝰蛇毒凝血因子X激活剂(RVV-X)激活人或小鼠血浆FX,检测其对血浆FXa活性的抑制作用。3、动物实验:氯化铁诱导的大鼠下腔静脉血栓形成模型,研究TAP-SSL5的抗血栓形成作用;大鼠颈动脉球囊损伤模型,给予TAP-SSL5(3 mg/kg/d, i.p)三周,对照组给予等量生理盐水,了解TAP-SSL5对血管损伤后新生内膜形成的影响;为研究TAP-SSL5对动脉粥样硬化斑块形成的影响,选取12周龄雄性apoE基因敲除(apoE-/-)小鼠,高脂饲养,并同时给予TAP-SSL5(3mg/kg/d, i.p),对照组给予等量生理盐水,每组10只,12周后取小鼠主动脉,检测AS斑块的形成情况,并蛋白芯片技术检测血管壁炎症因子的表达。结果:1、TAP-SSL5可与粒细胞及HL60细胞,并竞争性抑制KPL-1的;30μg/ml TAP-SSL5可抑制人中性粒细胞和HL60细胞在P-selectin表面的黏附,抑制率分别为67.9%和81.6%(p0.001);TAP-SSL5对FXa活性的抑制作用呈浓度依赖性,终浓度为3μM的TAP-SSL5即可对FXa产生的抑制作用,纯化FXa、小鼠血浆、人血浆检测到的抑制率分别为93.7%、75.5%和94.7%(p0.001)。2、单次静脉注射3mg/kg的TAP-SSL5,即可抑制FeCl3诱导的大鼠下腔静脉血栓形成,抑制率达52.7%(p0.001);TAP-SSL5可抑制大鼠颈动脉损伤后的新生内膜形成,与对照组相比,可使新生内膜面积减少32.0%(p0.05),使内膜/中膜厚度比值(intima-media thickness ratio)减少41.9%(p0.001);TAP-SSL5还可抑制apoE-/-小鼠AS斑块的形成,且可抑制小鼠主动脉壁中多种炎症因子的表达。:重组融合蛋白TAP-SSL5可抑制粒细胞在P-选择素表面的黏附,以及抑制FXa的活性;实验证实TAP-SSL5可抑制血栓形成,抑制动脉血管损伤后新生内膜形成及高脂饲养apoE-/-小鼠AS斑块的形成,这些作用均与TAP-SSL5所具有的抗凝和抗炎症活性有关,重组融合蛋白TAP-SSL5有望治疗血管损伤性及血栓性疾病的生物制品类新药。关键词:动脉粥样硬化论文炎症论文抗凝论文蜱抗凝血肽论文金葡萄球菌超抗原样蛋白-5论文P-选择素糖蛋白配体-1论文凝血因子Xa论文

    英文缩写词一览表5-7

    英文摘要7-9

    中文摘要9-11

    重组融合蛋白TAP-SSL5 表达载体的构建及纯化11-39

    引言11-12

    节 重组融合蛋白TAP-SSL5 表达载体的构建与鉴定12-28

    与试剂12-14

    方法14-20

    结果20-28

    节 重组融合蛋白TAP-SSL5 的表达与纯化28-37

    与试剂28-31

    方法31-34

    结果34-37

    讨论37-38

    小结38-39

    重组融合蛋白TAP-SSL5 的抗炎和抗凝功能研究39-67

    节 重组融合蛋白TAP-SSL5 的体外功能实验研究39-50

    与试剂39-41

    方法41-45

    结果45-49

    讨论49-50

    节 重组融合蛋白TAP-SSL5 在体功能实验研究50-66

    试剂与50-53

    方法53-57

    结果57-64

    讨论64-66

    小结66-67

    全文总结67-68

    致谢68-69

    附图69-70

copyright 2003-2024 Copyright©2020 Powered by 网络信息技术有限公司 备案号: 粤2017400971号