本站原创摘要4-6
ABSTRACT6-16
章 绪论16-28
1.1 P的发现16
1.2 P的物理性质16-17
1.3 P的分布17-18
1.4 P的生物学功能18-19
1.4.1 P作为醌蛋白的辅酶，参与呼吸链的电子传递18
1.4.2 P是机体生长刺激因子18
1.4.3 调节机体自由基，保护机体18-19
1.4.4 促进神经生长因子产生，修复神经生长因子19
1.5 P的生物合成19-21
1.6 P的合成基因21-24
1.6.1 pA22
1.6.2 pB22-23
1.6.3 pC和pD23
1.6.4 pE23-24
1.6.5 pF和pG24
1.7 P生物合成的调控24-25
1.8 PGDH的介绍25-26
1.9 本课题的立项26-28
章 克隆肺炎克雷伯氏菌P基因并构建工程质粒28-46
2.1 引言28
2.2 实验28-29
2.2.1 菌株与质粒28
2.2.2 试剂与仪器28-29
2.2.3 培养基29
2.3 实验方法29-40
2.3.1 肺炎克雷伯氏杆菌肺炎亚种基因组DNA的提取29-30
2.3.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增p 2K片段30-31
2.3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定目的基因p 2K片段并回收31
2.3.4 pET-28a质粒载体的提取31-32
2.3.5 酶切连接构建质粒Ⅰ(pET28a-2K)32-33
2.3.6 转化33-34
2.3.7 菌落PCR筛选阳性克隆34
2.3.8 质粒Ⅰ(pET28a-2K)的酶切鉴定34-35
2.3.9 PCR扩增p 5K片段35-37
2.3.10 质粒Ⅰ(pET28a-2K)和5K DN段的酶切连接及转化37-38
2.3.11 菌落PCR筛选阳性克隆38-40
2.3.12 转化大肠杆菌BL2140
2.4 结果与讨论40-45
2.4.1 K. pneumoniae subsp.pneumoniae基因组DNA的提取40-41
2.4.2 P 2K片段PCR扩增41
2.4.3 pET28a质粒提取41-42
2.4.4 酶切连接后转化42
2.4.5 2K片段菌落PCR42-43
2.4.6 5K片段PCR扩增43
2.4.7 连接转化后菌落PCR43-44
2.4.8 提取质粒单、双酶切鉴定44-45
2.5 小结45-46
章 工程菌表达P的研究46-52
3.1 引言46
3.2 实验46-47
3.2.1 菌株与质粒46-47
3.2.2 试剂与仪器47
3.2.3 培养基47
3.3 实验方法47-48
3.3.1 工程菌诱导表达P47-48
3.3.2 非酶系统测定P含量48
3.3.3 基本培养基发酵生产P48
3.4 结果与讨论48-50
3.4.1 工程菌生成P的检测48-49
3.4.2 基本培养基发酵生产P的检测49-50
3.5 小结50-52
章 克隆大肠杆菌gcd基因并构建工程质粒52-64
4.1 引言52
4.2 实验52-53
4.2.1 菌株与质粒52
4.2.2 试剂与仪器52-53
4.2.3 培养基53
4.3 实验方法53-59
4.3.1 Escherichia cop BL21基因组DNA的提取53-54
4.3.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增gcd基因54-55
4.3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定目的基因gcd片段并回收55
4.3.4 pET-28a质粒载体的提取55-56
4.3.5 酶切连接56-57
4.3.6 转化57-58
4.3.7 菌落PCR筛选阳性克隆58
4.3.8 pET28a-gcd的酶切鉴定58-59
4.4 结果与讨论59-63
4.4.1 E.cop BL21基因组DNA的提取59-60
4.4.2 gcd基因片段PCR扩增60
4.4.3 pET28a质粒提取60-61
4.4.4 酶切连接后转化61
4.4.5 2K片段菌落PCR61-62
4.4.6 提取质粒单、双酶切鉴定62-63
4.5 小结63-64
第五章 工程菌表达PGDH的研究64-72
5.1 引言64
5.2 实验64-65
5.2.1 菌株与质粒64
5.2.2 试剂与仪器64-65
5.2.3 培养基65
5.3 实验方法65-66
5.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定重组蛋白65-66
5.3.2 pET28a-gcd工程菌的表达条件优化66
5.4 结果与讨论66-70
5.4.1 SDS-PAGE检测分析PGDH67
5.4.2 葡萄糖对PGDH表达量的影响67-68
5.4.3 MgCl_2对PGDH表达量的影响68-70
5.5 小结70-72
第六章 实验总结与建议72-74
6.1 主要72
6.2 本课题创新点72-73
6.3 问题与建议73-74