重组慢病毒介导PPM1B基因转染延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩基础

摘要：肌萎缩是公认的世界疑难病症，以失神经肌萎缩为例，其一旦发生则呈性不可逆发展，尚无措施及药物可完全阻断这一病程，给患者及其家庭带来了沉重的精神和经济负担。因此,探讨失神经肌萎缩发病的分子机制及寻找新的治疗方法显得尤为和迫切。迄今的研究已经明确，失神经骨骼肌的萎缩是由分子信号通路掌控，IKKβ/NF-κB通路在其中占有的作用。磷酸化的IKKβ去磷酸化与否可能对失神经骨骼肌的发生发展有。依赖镁/锰离子的蛋白磷酸酶1B (PPM1B)可以使磷酸化的IKKβ的丝氨酸177和丝氨酸181位点发生去磷酸化，同时减弱IKKβ的活性。过表达PPM1B可以终止由TNF-α诱导的IKKβ/NF-κB通路的活性。基因治疗为失神经骨骼肌萎缩的防治开辟了更广阔的前景，已有学者发现应用神经营养因子、转化生长因子等基因转染和转基因小鼠的方法对延缓肌萎缩有较好的效果。受此启发，本课题尝试基因转染技术来促进PPM1B基因过表达，使失神经肌萎缩的通路在上游及时控制，借此来抑制IKKβ/NF-κB通路的活性，探讨其延缓骨骼肌萎缩的疗效，为研究失神经骨骼肌萎缩的分子机制及该因子的药物和基因干预实验依据。PPM1B和P-IKKβ在失神经肌萎缩中的表达变化及目的探讨失神经骨骼肌萎缩中依赖镁/锰离子的蛋白磷酸酶1B (PPM1B)和磷酸化的抑制核转录因子κB激酶β(P-IKKβ)的表达变化及。方法30只SD大鼠建立右下肢腓肠肌失神经支配模型，实时定量PCR和Western blot，分别检测失神经支配第2、7、14和28天的腓肠肌中PPM1B mRNA和蛋白的表达变化以及P-IKKβ，IKKβ蛋白的表达变化，并分析PPM1B，P-IKKβ与肌萎缩（肌肉湿重维持率）的性。结果1、实时定量PCR分析结果PPM1B mRNA的表达在失神经支配后第2天已开始下降，迅速降为对照组的0.41倍，此后表达持续下降，到第28天时降为对照组的0.07倍，各组与对照组相比差异均具有统计学（P0.05）。2、Western blot灰度分析结果PPM1B蛋白的变化与mRNA相同的趋势，但是变化幅度较转录为低；失神经2天表达持续下降，第7天降为对照组的0.56倍，到第28天时降为对照组的0.24倍。失神经术后第2天与对照组相比差异无统计学(P0.05)，第7，14，28天与对照组相比差异有统计学(P0.05)。P-IKKβ蛋白的表达从早期即开始增高，失神经第2天为对照组的1.37倍，并失神经时间的推移而呈持续增加趋势，到第28天为对照组的1.74倍。各组与对照组相比差异均具有统计学（P＜0.05）。IKKβ蛋白的表达呈持续下降的趋势，下降幅度较小。各组与对照组相比差异均具有统计学（P＜0.05）。3、关联性分析PPM1B与P-IKKβ表达呈现负性（P＜0.01）；PPM1B表达降低与肌湿重比成线性正关系（P＜0.01）。在SD大鼠失神经骨骼肌萎缩早期，PPM1B的表达为下调，P-IKKβ的表达为上调；PPM1B和P-IKKβ在失神经骨骼肌的表达强度与肌萎缩密切，二者共同作用参与失神经骨骼肌的发生发展。基因治疗促进PPM1B基因表达使其上调，来延缓失神经骨骼肌萎缩，应在失神经后越早越好。PPM1B基因慢病毒载体的构建与鉴定目的构建PPM1B基因重组慢病毒载体，为其体外实验奠定基础。方法PPM1B基因的CDS序列，对大鼠PPM1B基因ORF克隆，阳性克隆经菌落PCR验证及测序验证后，将测序正确的T-PPM1B双酶切，与双酶切后的pLenti6.3/V5DEST(MCS)-IRES-EGFP相连接，菌落PCR及酶切鉴定筛选出阳性克隆，测序。保留正确的pLenti-EGFP-PPM1B，提纯后与包装质粒共转染293T细胞，病毒原液，经纯化和浓缩后，测序分析鉴定。结果1、构建的慢病毒表达载体pLenti-EGFP-PPM1B经过测序验证与GenBank中PPM1B的CDS序列完全一致。2、慢病毒表达载体转染到293T细胞，荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达，病毒液的滴度值为1.15×107ifu/ml，实时定量PCR检测病毒液中PPM1B基因表达量是阴性对照液中的297.48倍。成功构建了PM1B基因慢病毒载体，为下一步体外实验奠定了基础。重组慢病毒体外促进PPM1B的表达目的探讨重组慢病毒体外促进PPM1B基因表达的效果，为重组慢病毒介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗奠定基础。方法6孔细胞培养板中培养大鼠成肌细胞系L6，感染L6细胞，摸索最佳MOI值。将培养好的L6细胞分为三组，分别为无干预因素的未感染组，感染Lenti-EGFP空载体病毒的对照组，感染Lenti-IRES2-EGFP-PPM1B的病毒组，相应的感染后72h，取各组细胞于共聚焦荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达、以发绿色荧光细胞的平均数与总细胞平均数的比值来估计感染的效率、Western blot检测PPM1B蛋白的表达。结果1、慢病毒感染L6大鼠成肌细胞的MOI值选取MOI=20为最佳。2、病毒组感染后72h，荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达，了系统较高的感染效率。3、Western blot灰度分析，感染后72h，病毒组PPM1B基因的蛋白表达较对照组和未感染组升高，分别是它们的15.3倍和14.9倍，差异具有统计学(P0.05)。对照组与未感染组相比，PPM1B蛋白表达无性差异(P0.05)。成功验证了重组慢病毒可以促进细胞中PPM1B的蛋白表达，为下一步在活体内研究其功能以及基因靶向治疗奠定了基础。重组慢病毒介导PPM1B基因转染延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩目的探讨重组慢病毒介导的PPM1B基因转染延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩的疗效。方法将30只SD大鼠，随机分为实验组和对照组，每组15只。切断坐骨神经，建立右下肢失神经支配萎缩模型。于实验组和对照组失神经趾长伸肌分别感染重组慢病毒载体Lenti-EGFP-PPM1B和Lenti-EGFP溶液50μl(107IU/ml),转染2、4周，每个时间点分别取3只大鼠，于共聚焦荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达，取6只大鼠，Western blot检测PPM1B、P-IKKβ和IKKβ的表达；取6只大鼠测定肌湿重、肌细胞直径、肌细胞横截面积，并观察肌纤维超微结构的变化。结果慢病毒转染2、4周，两组趾长伸肌均可见大量EGFP表达。Western blot检测实验组失神经趾长伸肌中均有大量的PPM1B表达，分别为对照组的6.8倍与4.9倍（P均0.01）。实验组中P-IKKβ蛋白较对照组减少，分别为对照组的45%与62%；实验组中IKKβ蛋白较对照组增多，分别为对照组的4.2倍与2.8倍（P均0.05）。转染2周，实验组肌湿重维持率、肌细胞直径和肌细胞横截面积分别为(63.28±4.17)%, (30.86±4.24)μm和(880.72±70.54)μm~2，均高于对照组(52.43±3.92)%, (21.39±3.87)μm和(705.27±53.19)μm~2；4周时，实验组上述各项指标为(45.13±4.95)%, (23.64±3.06)μm和(720.15±38.46)μm~2，仍高于对照组(35.31±4.72)%, (18.66±3.23)μm和(543.67±42.65)μm~2（P均0.01）。，实验组与对照组相比，肌纤维超微结构改变减轻，肌浆网的扩张减轻。在大鼠失神经骨骼肌中，过表达PPM1B基因，可以降低IKKβ/NF-κB通路的活性起到延缓肌萎缩的作用。慢病毒介导的基因治疗有较高的转染效率，其介导的PPM1B基因转染能延缓大鼠失神经骨骼肌的萎缩，其疗效至少可以维持4周。关键词：神经论文肌萎缩论文PPM1B论文P-IKKβ论文IKKβ论文病毒载体论文ORF克隆论文PPM1B论文成肌细胞系论文细胞感染论文PPM1B论文肌萎缩论文失神经萎缩论文基因转染论文PPM1B论文

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英文缩写词表13-15

前言15-18