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摘要：大黄鱼（Pseudosciaena crocea）是我国人工育苗和养殖规模最大的海水鱼类，但目前养殖大黄鱼已经出现了种质资源衰退和遗传多样性降低，有必要进行种质改良，培育优良品种。雌核发育是一种特殊的有性生殖方式，其子代遗传物质全部来自母本。通过诱导雌核发育，不但可以快速建立纯系、固定优良性状，还可以为探讨性别决定机制、繁育单性群体奠定基础。已有探讨显示利用同源灭活精子诱导的大黄鱼雌核发育中可能会因灭活不完全导致部分子代中掺有父本遗传物质。为避开此现象，本探讨以不经灭活的鮸鱼精子和紫外灭活的黄姑鱼精子作为异源激活源，通过冷休克处理诱导染色体组加倍，成功诱导了大黄鱼雌核发育二倍体（可调式精子灭活装置和温度休克处理装置均为自行研制，均已获得专利）。通过对冷休克处理起始时刻、温度和持续时间的探讨，得到异源精子诱导大黄鱼雌核发育的最佳冷休克处理条件为授精后2-3min将受精卵置于3-4°C过滤海水中处理10-13min。在此冷休克处理条件下，利用不经灭活的鮸鱼精子和紫外灭活的黄姑鱼精子作为激活源均可得到大黄鱼雌核发育子代，SSR标记扩增浅析结果显示两种异源精子诱导得到的大黄鱼雌核发育子代中均只出现母本条带而未出现父本条带；形态观察和染色体浅析显示40-50日龄幼鱼外部形态与普通大黄鱼幼鱼相同，且均为含有48条染色体的二倍体，表明子代全部为雌核发育二倍体。对以紫外灭活的同源（大黄鱼）精子和未灭活的异源（鮸鱼）精子诱导的雌核发育大黄鱼进行了胚胎发育时程和SSR标记浅析的比较，结果显示：（1）异源组的受精率和孵化率分别为41.33±0.58%和36.67±0.58%，分别高于同源组的20.67±1.52%和24.67±0.58%；但异源组的存活率为3.28±0.09%，低于同源组的6.93±0.15%；（2）两组中经冷休克处理未能恢复倍性的胚胎发育畸形而陆续死亡，恢复倍性的胚胎在发育程序上均与普通大黄鱼相同，但由于冷休克处理导致了发育的延迟，各阶段出现时间较对照组滞后：同源组和异源组在胚盘形成时分别滞后3min和2min，至低囊胚期分别滞后35min和45min，至原肠晚期分别滞后55min和1h，至心跳期分别滞后50min和1h45min，至出膜时分别滞后1h和1h30min；（3）两对SSR引物（KPC9和KP5）对同源组的扩增浅析显24尾子代中有20尾在两个位点均未出现父本条带，为雌核发育个代，占83.3%；3尾在两个位点均出现父本条带，为正常受精个体，占12.5%；1尾仅在KPC9位点出现父本条带，可能是灭活不完全精子中的部分DN段进入了子代，占4.17%；SSR引物KP3对异源组的扩增浅析显示18尾子代中均未出现父本条带，全部是雌核发育产物。结果表明以灭活的同源（大黄鱼）精子和未经灭活的异源（鮸鱼）精子诱导大黄鱼雌核发育各有优缺点，需根据具体情况选择利用。为更好的对鮸鱼精子诱导的雌核发育大黄鱼进行检测浅析，同时也为今后鮸鱼这一经济鱼类的遗传多样性浅析、种质资源保护以及石首鱼科的种系进化探讨奠定基础，利用磁珠富集法构建了鮸鱼的SSR文库，挑选247个阳性克隆测序后获得138个含有SSR核心单元的独特序列，对其中35个序列设计了37对SSR引物，在象山港鮸鱼养殖群体进行扩增、浅析，结果显示有30对引物可扩增到清晰、特异的目的条带，其中24个位点呈多态性，6个位点呈单态性。24个多态性引物的等位基因数为2-8个，平均每个位点4.33个；观察杂合度（Ho）为0.0667-1.0000，平均0.6361；期望杂合度（He）为0.3828-0.8139，平均0.6443；PIC值范围为0.348-0.823，平均0.576，其中17个呈高度多态性（PIC0.5）；8个位点偏离哈代平衡，可能与群体内小范围的非随机交配和人工育种有关，某些位点杂合度很低，也可能与采样群体较小有关。将筛选得到的30对鮸鱼SSR引物在象山港养殖大黄鱼群体中进行交叉扩增，结果显示有12对引物可稳定扩增且条带清晰，交叉扩增的成功率为40.00%，其中10对呈多态性，2对为单态性。10个多态性引物的等位基因数为2-8个，平均每个位点5.10个；观察杂合度（Ho）为0.0000-0.8667，平均0.5200；期望杂合度（He）为0.0655-0.8492，平均0.6053。10个位点的PIC值范围为0.062-0.815，平均0.555，其中6个呈高度多态性（PIC0.5）；4个位点偏离哈代平衡。对大黄鱼和鮸鱼中相同引物的扩增序列进行比对，结果显示除MM007位点的相似度较低外（51.08%），其他位点相似度均较高（89.63%-99.36%）；除核心单元的重复次数不同外，微卫星侧翼序列在鮸鱼和大黄鱼间也有着差别，体现为个别碱基的转换/颠换或一段序列的插入/缺失。用4对交叉扩增成功的引物对鮸鱼精子诱导的雌核发育大黄鱼进行扩增浅析，结果显示4个引物都可以在父本和母本间扩增出清晰的差别性条带，子代在4个微卫星位点均只出现母本条带而没有父本条带，表明子代是真正的雌核发育产物，同时多个位点的检测结果也证明精子中的遗传物质既没有以染色体形式也没有以DN段形式进入子代。现有的核型浅析显示大黄鱼没有异型分化的性染色体，目前尚无法鉴定大黄鱼的遗传性别。利用AFLP技术对雌、雄大黄鱼进行条带比较浅析，结果显示64对选择性扩增引物组合中除E-ACC/M-CAT外均可得到清晰的条带，但仅引物组合E-ACC/M-CTG扩增到一条在雌、雄大黄鱼间显著差别的条带，表明大黄鱼雌性和雄性的基因组差别极小。将引物组合E-ACC/M-CTG扩增到的仅在雄鱼中出现差别条带进行回收测序，来自4个雄性个体的差别条带测序成功，结果显示虽然长度都是188bp，但为两段不同的序列，经BLAST搜索，两条序列在GenBank中均无同源序列。对两条序列分别设计引物进行PCR扩增检验，结果显示两对引物在雌性和雄性个体中都可扩增到条带，推测此AFLP条带可能是由DNA序列修饰（如化等）和酶切识别等因素共同作用产生的性别差别性条带。综上所述，本探讨建立了异源（鮸鱼、黄姑鱼）精子诱导大黄鱼雌核发育的技术系统，除幼鱼外部形态观察和染色体浅析外，还利用已发布的大黄鱼、黄姑鱼SSR引物对大黄鱼雌核发育子代进行了鉴定和比较浅析，以个体、细胞和分子遗传等多个水平上确认了雌核发育的真实性，并对同源和异源精子诱导的雌核发育大黄鱼进行了胚胎发育时程的观察和比较；通过磁珠富集法筛选了30对鮸鱼SSR引物，并将这些引物在大黄鱼中进行交叉扩增，对交叉扩增成功的12对引物进行了鮸鱼、大黄鱼间的扩增序列比较并运用于鮸鱼精子诱导大黄鱼雌核发育子代的鉴定；利用AFLP技术对雌、雄大黄鱼基因组进行了扩增条带的比较浅析，找到一条仅在雄鱼中出现的差别条带。这些结果为大黄鱼雌核发育、群体遗传结构浅析、性别决定与性别分化、石首鱼科种系进化等论述探讨提供资料，也为大黄鱼遗传育种、种质保护以及单性群体繁育等运用性探讨奠定了基础，但雌核发育大黄鱼的生长发育特别是性腺发育情况以及遗传性别的鉴定等不足仍有待于更加深入的探讨。关键词：大黄鱼论文雌核发育论文微卫星标记论文磁珠富集论文AFLP标记论文
论文摘要4-6
Abstract6-10
引言10-11
第一章 文献综述11-31
1 大黄鱼探讨近况11-16
2 鱼类雌核发育探讨概况16-23
3 鱼类分子标记探讨进展23-31
第二章 鮸鱼和黄姑鱼精子诱导大黄鱼雌核发育31-42
1 前言31
2 材料与策略31-36
3 结果36-40
4 讨论40-42
第三章 同源和异源（鮸鱼）精子诱导大黄鱼雌核发育的比较42-49
1 前言42
2 材料和策略42-44
3 结果44-47
4 讨论47-49
第四章 磁珠富集法筛选鮸鱼微卫星引物49-63
1 前言49
2 材料与策略49-56
3 结果56-61
4 讨论61-63
第五章 鮸鱼SSR 引物在大黄鱼中交叉扩增及雌核发育子代鉴定中的运用63-72
1 引言63
2 材料与策略63-64
3 结果64-66
4 讨论66-72
第六章 大黄鱼性别特异性AFLP 标记的筛选72-83
1 前言72-73
2 材料与策略73-76
3 结果76-81
4 讨论81-83
第七章 革新点与探讨展望83-84
1 革新点83
2 探讨展望83-84
录C 专利证书102-105在学探讨成果105-108
一、在学期间取得的科研成果105
二、在学期间所获的奖励105
三、在学期间发表的论文105-106
四、在学期间获得的专利106-108
致谢108