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摘要：目的：许多眼科疾病和外伤，如青光眼、视神经缺血、顿挫伤、视神经管骨折等，都可以使视网膜节细胞（retinal gangponcells, RGCs）不可逆性凋亡，最终导致视觉功能障碍。目前对于此类疾患仍无有效的治疗策略。视神经和视网膜作为中枢神经系统（central nervous system, CNS）在颅外的延伸，在动物手术位置上具有优越性，因而视神经损伤模型又常被用来模拟CNS的损伤。由此，本探讨以组织工程的角度，构建大鼠羊膜上皮细胞(amniotic epithepal cells, AECs)与胶原海绵复合体，将其移入大鼠视神经损伤模型中，探讨其对损伤视神经及CNS的作用。策略：1)取妊娠晚期的SD大鼠，用胰蛋白酶序贯消化法获得原代AECs，用免疫细胞化学策略检测AECs是否表达CK19、COX10及Nestin，用PKH26标记第3代AECs。2)构建AECs与胶原海绵复合体，在荧光显微镜下观察复合体内AECs的存活。3)将SD大鼠随机分为4组：正常组、单纯损伤组、空支架组和复合体组。单纯损伤组：在左眼视后约2mm处用1mm注射器针头切开视神经外膜，完全吸除长约0.5mm的视神经，保持神经外膜的主要血管不受损伤；空支架组：在视神经的吸断处移植相应大小的胶原海绵；复合体组：在视神经的吸断处注入10μl密度为1×107个/ml的细胞悬液后，移植相应大小的复合体。4)观察胶原海绵和复合体与视神经的组织相容性。术后第7天计数复合体内的AECs并检测其Nestin的表达。术后第28天，观察AECs与再生轴突的联系。5)检测复合体移植对RGCs的作用：HE染色、尼氏染色、CTB-FITC顺行示踪和免疫组织化学法检测MAP-2在视网膜中的表达。6)检测复合体移植对视神经的作用：HE染色、CTB-FITC顺行示踪和免疫组织化学法检测GFAP、GAP-43在视神经中的表达。7)用Panorama Maker5软件拼接图片，用Photoshop CS3软件计数和测量长度，用Image Pro Plus6.0软件测量面积，用SPSS18.0软件进行统计浅析。结果：1)体外培养的AECs可以表达CK19、COX10和Nestin，AECs具有干细胞特性和向神经类细胞分化的潜能。2)复合体内的AECs生物活性好，细胞密度为604.3个/mm2，48%的AECs表达Nestin，复合体内部分细胞仍具有向神经类细胞分化的潜能。3)术后第28天至第56天，视神经内基本不见胶原海绵的空间物理结构，胶原海绵和复合体与视神经的组织相容性好。术后7天复合体内存活的AECs密度为424.7个/mm2，17%的AECs表达Nestin。复合体内的AECs至少到第28天还有存活，并可向损伤区两侧迁移。复合体内的AECs与再生轴突伴行。复合体内AECs存活率较高，部分AECs具有向神经类细胞分化的潜能，复合体利于改善视神经再生的微环境。4)视网膜的尼氏染色显示：术后第28天，空支架组节细胞层细胞直径≥12μm的细胞数量和细胞总数多于单纯损伤组，复合体组又多于空支架组；细胞直径＜12μm的细胞数量，空支架组和复合体组多于单纯损伤组。复合体可增加视网膜内各类细胞的数量，特别是大细胞；胶原海绵的作用相对较小。5）视网膜的HE染色显示：术后第28天和第56天，各实验组的节细胞层细胞数、内网层厚度和内核层厚度均比正常组少。节细胞层细胞数，术后第28天复合体组多于单纯损伤组和空支架组，术后第56天复合体组多于空支架组；内网层厚度和内核层厚度，术后第56天复合体组和空支架组均高于单纯损伤组。复合体比胶原海绵对节细胞层细胞数、内网层和内核层的增加作用更显著。6）CTB-FITC示踪的RGCs胞体及其视网膜内轴突显示：术后第28天和第56天，各实验组视网膜、中间和外周的CTB-FITC阳性区域面积比例均低于正常组。：术后第28天复合体组最高，空支架组次之，单纯损伤组最低；术后第56天复合体组和空支架组均高于单纯损伤组。中间：术后第28天各实验组无显著差别，术后第56天复合体组高于空支架组和单纯损伤组。外周：术后第28天各实验组无显著差别；术后第56天复合体组高于单纯损伤组。复合体和胶原海绵可增加视网膜内存活的RGCs及其轴突，前者效果更为显著。7）CTB-FITC示踪的视神经显示：术后第28天和第56天，近侧段和损伤区的CTB-FITC阳性区域面积比例，复合体组最高，空支架组次之，单纯损伤组最低。复合体比胶原海绵更能增加再生轴突的数量，复合体移植后可推动再生的轴突穿过损伤区到远侧段815μm处。8）免疫组织化学染色显示：术后第28天，各实验组视网膜每个视野内MAP-2阳性物质积分光密度均低于正常组，复合体组最高，空支架组次之，单纯损伤组最低，复合体增加视网膜内神经元存活的作用强于胶原海绵。术后第28天和第56天损伤区GFAP阳性物质平均积分光密度，单纯损伤组复合体组最高，空支架组次之，复合体组最低，复合体使损伤区GFAP表达减少的作用大于胶原海绵。术后第28天组损伤区GAP-43阳性物质平均积分光密度，复合体组最高，空支架组次之，单纯损伤组最低，复合体使损伤区GAP-43表达增加的作用大于胶原海绵。结论：1)胶原海绵的空间物理结构有利于AECs粘附和存活。2) AECs胶原海绵复合体移植可发挥AECs与胶原海绵的协同作用，改善视神经轴突再生的局部微环境，增加RGCs的存活量，推动视神经轴突的再生。3) AECs胶原海绵复合体用于修复视神经损伤的策略是可行的。关键词：视神经论文视网膜论文视网膜节细胞论文羊膜上皮细胞论文胶原海绵论文神经损伤论文再生论文微环境论文
摘要6-9
Abstract9-12
缩略词表12-13
前言13-16
材料和策略16-25
一、主要试剂和设备16-17
二、AECs 的培养与鉴定17-19
三、AECs 胶原海绵复合体的培养及细胞活性评估19-20
四、动物模型的制作和分组20-21
五、视神经的示踪—玻璃体注射 CTBFITC21-22
六、视网膜铺片22
七、视网膜尼氏染色和细胞计数22
八、视神经的冰冻切片22-23
九、石蜡切片23
十、视神经和视网膜的 HE 染色23
十一、免疫组织化学染色23-24
十二、视网膜节细胞层细胞数、内网层厚度和内核层厚度的计算24
十三、免疫组化染色的积分光密度浅析24
十四、CTBFITC 示踪的 RGCs 轴突面积的计算24-25
十五、统计学处理25
结果25-52
一、AECs 的培养及鉴定25-27
二、AECs 胶原海绵复合体27-31
三、复合体对视网膜节细胞的作用31-41
四、复合体对视神经的作用41-46
五、视神经的免疫组织化学染色结果46-52
讨论52-58
一、动物模型的可靠性及作用52
二、胶原海绵为 AECs 提供良好的三维存活空间52-53
三、AECs 胶原海绵复合体可改善视神经再生微环境53-55
四、AECs 胶原海绵复合体对 RGCs 的保护作用55-56
五、AECs 胶原海绵复合体对视神经再生的推动作用56-58
附录58-62