摘要：目的：糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病主要的微血管并发症之一,以血管新生为病变特点的增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)是糖尿病患者致盲的重要理由。已有探讨表明糖基化终末产物(AGEs)水平与增殖性糖尿病视网膜病变严重程度呈正相关联系,即AGEs可能参与PDR发病。我们前期探讨结果提示第V结构域缺失型β2糖蛋白Ⅰ(p2-GPI Domain I-IV)可抑制人脐静脉内皮细胞血管新生。本探讨以猴脉络膜-视网膜内皮细胞(RF/6A)为探讨对象,旨在探讨：1.DI-IV对AGEs促RF/6A血管新生作用的影响；2.DI-IV影响AGEs促RF/6A血管新生作用的机制。策略：1.培养RF/6A细胞。实验共分为5组：①NC组为对照组不加干预因素；②GEs组加入100μg/ml AGEs;③10nM DI-IV组加入100μg/ml AGEs及10nM DI-Ⅳ;④100nM DI-IV组加入100μg/ml AGEs及100nM DI-IV；⑤400nM DI-Ⅳ组加入100μg/ml AGEs及400nM DI-IV。2.分别用MTS法、“伤口愈合”实验和体外Matrigel法探讨不同浓度DI-IV对AGEs促RF/6A细胞增殖、细胞迁移以及新生血管形成的影响。3.用实时定量PCR法探讨DI-IV对AGEs于预下RF/6A VEGF受体VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR) mRNA表达的影响。4.用Western Blot法探讨DI-IV对AGEs干预下RF/6A VEGF细胞内信号转导途径关键蛋白Akt蛋白磷酸化的影响。结果：1. AGEs能显著刺激RF/6A细胞增殖(p0.05),此作用能被不同浓度DI-IV所抑制,其中10nM和400nM DI-Ⅳ的抑制作用最强(p0.01)。2. AGEs显著增加RF/6A向裸露区迁移率达1.55倍(p0.01),加入不同浓度DI-IV后,这种迁移受到不同程度抑制,其中400nM DI-IV的抑制作用最强,高达47.6%(p0.05)3. AGEs能显著推动RF/6A体外血管形成达70%(p0.01),加入不同浓度DI-IV,此血管形成受到不同程度地抑制,其中400nM DI-IV的抑制作用最大,高达27.4%(p0.05)4. AGEs能显著降增加VEGFR-2mRNA表达量(p0.01),不同浓度DI-IV均能抑制其表达,400nM DI-IV的抑制作用最强(p0.01)。各组间VEGFR-1mRNA表达量相当,没有统计学差别。5. AGEs干预细胞后,显著增加Akt蛋白磷酸化(p0.05),不同浓度DI-IV可不同程度地抑制其磷酸化(p0.01)结论：1. AGEs能推动RF/6A细胞增殖、迁移及管腔形成,可能机制为增加VEGFR-2表达,活化Akt以及下游信号转导通路。2. DI-Ⅳ能拮抗AGEs促RF/6A细胞增殖、迁移及管腔形成的作用,可能的机制为拮抗VEGF/VEGFR-2/Akt信号转导通路。3. VEGFR-1在RF/6A细胞增殖、迁移及管腔形成历程中,作用甚微。关键词：糖尿病视网膜病变论文血管新生论文糖基化终末产物论文第Ⅴ结构域缺失型论文β2糖蛋白Ⅰ论文
中文摘要4-6
Abstract6-11
縮略语/符号说明11-13
前言13-16
探讨近况、探讨成果13-14
探讨目的和策略14-16
第一部分 细胞形态学实验16-27
1.1 探讨对象与材料16-18
1.1.1 探讨对象16
1.1.2 主要试剂16
1.1.3 主要试剂配制16-17
1.1.4 主要仪器设备17-18
1.2 实验策略18-23
1.2.1 细胞培养和实验分组18-20
1.2.2 细胞增殖实验(MTS法)20-21
1.2.3 细胞迁移实验(“伤口愈合”实验)21
1.2.4 管腔形成实验(体外Matrigel实验)21-22
1.2.5 统计学浅析22-23
1.3 实验结果23-26
1.3.1 DI-Ⅳ抑制AGEs促RF/6A细胞增殖23
1.3.2 DI-Ⅳ抑制AGEs促RF/6A细胞迁移23-25
1.3.3 DI-Ⅳ抑制AGEs促RF/6A新生血管形成25-26
1.4 小结26-27
第二部分 分子生物学实验27-43
2.1 探讨对象和材料27-31
2.1.1 探讨对象27
2.1.2 主要试剂27-28
2.1.3 主要试剂配制28-30
2.1.4 主要仪器设备30-31
2.2 实验策略31-40
2.2.1 DI-Ⅳ对AGEs刺激下RF/6A VEGF受体mRNA表达的影响31-35
2.2.2 DI-Ⅳ对AGEs刺激下RF/6A VEGF细胞内信号转导通路的影响35-39
2.2.3 统计浅析39-40
2.3 实验结果40-42
2.3.1 DI-Ⅳ可拮抗AGEs促VEGFR-2 mRNA表达40
2.3.2 DI-Ⅳ可影响VEGF细胞内信号转导通路关键蛋白的表达40-42
2.4 小结42-43
第三部分 讨论43-52
3.1 糖尿病血管新生43-44
3.1.1 流行病学43
3.1.2 血管新生与糖尿病并发症43-44
3.2 VEGF与血管新生44-46
3.2.1 VEGF的分类及功能44
3.2.2 VEGF的作用机制44-45
3.2.3 VEGF与血管新生45-46
3.3 AGEs与血管新生46-48
3.3.1 非酶糖基化反应形成AGEs46
3.3.2 AGEs的作用46-47
3.3.3 AGEs与血管新生47-48
3.4 β2-GPI与血管新生48-52
3.4.1 β2-GPI的结构48
3.4.2 β2-GPI的构象48-50
3.4.3 β2-GPI的功能50
3.4.4 β2-GPI在血管新生中的作用50-52
结论52-53
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