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摘要：目的：先天性非综合征性耳聋与人自身染色体上某些特定位点的变异相关。目前的检测手段不是比较昂贵就是操作繁琐容易出错，而且能够同时检测的突变位点非常有限。本课题探讨的目的在于开发一种可以同时检测大部分相关突变位点的具有快速、价廉、操作方便等特点的实时荧光PCR检测策略。运用本项技术开发的先天非综合征性耳聋相关突变位点检测策略不仅可以检测病人的突变位点，更重要的是可以在婚前，产前预防性筛查相关突变位点携带者，对提升人口素质，提升家庭生活质量有着重大作用。策略：查阅国内外相关文献，找出与中国人群先天性非综合征性耳聋相关的突变位点，根据NCBI Gene数据库中所列出的基因序列设计引物以CDNA文库克隆含目的突变位点的DN段，回收目的片段并连接入目标载体。设计突变引物，利用定点突变策略得到含有突变位点的重组质粒。利用建立起来的防污染仿基因组PCR反应系统以重组质粒为模板筛选针对突变型等位基因的等位基因特异性引物。设计针对每个突变位点的分子信标和内参信标，利用之前得到的等位基因特异性引物，优化筛选出检测突变型基因的多重实时荧光PCR反应条件。收集目标人群DNA样本，验证整个筛查系统的可行性和准确性。结果：经文献查找发现与中国人群先天性非综合征性耳聋相关的热点突变位点共有32个，实验克隆出了含目的突变位点的DN段，并且利用定点突变技术突变相应的基因序列，构建出含有目的基因片段的野生型重组质粒和突变型重组质粒；利用含鲑鱼精DNA的仿基因组系统和含有dUTP，尿嘧啶糖苷酶（UNG酶）的防污染系统筛选出针对各突变位点突变型等位基因的等位基因特异性引物；筛选出了针对各突变位点的分子信标并建立起了检测突变型等位基因的多重实时荧光PCR系统；利用已得到的筛查系统筛查收集到的73例样本，检测已建立的筛查系统的准确性，突变携带者的检出率为100%。结论：实验所建立的先天性耳聋相关突变位点荧光筛选策略能够快速、准确、稳定的筛选出突变型等位基因携带者。关键词：实时荧光PCR论文分子信标论文非综合征性耳聋论文
中文摘要4-6
Abstract6-10
前言10-14
实验材料14-19
第一章 中国人群非综合征性耳聋高频突变位点重组质粒模型的构建及等位基因特异性引物的筛选19-47
第一节 非综合征性耳聋高频突变位点重组质粒模板的构建19-33
材料和策略19-23
实验结果23-33
第二节 非综合征性耳聋高频突变位点突变检测引物的筛选33-43
材料与策略33-35
实验结果35-43
第三节 质粒检测系统中加入 SamlonDNA 可显著提升突变检测引物对突变位点识别的特异性43-45
材料和策略43-45
实验结果45
讨论与小结45-47
第二章 分子信标结合荧光定量多重 PCR 反应系统的建立47-69
第一节 各个突变位点分子信标的筛选47-59
材料与策略47-49
实验结果49-59
第二节 各突变位点多重 PCR 反应系统的建立59-67
材料与策略59-60
实验结果60-67
讨论与小结67-69
第三章 利用已建立的快速荧光筛查系统筛查已收集到的目标人群 DNA 样本69-73
材料与策略69-70
实验结果70-72
讨论与小结72-73
讨论73-75
结论75-76