摘要：高致病禽流感H5N1病毒引起了全世界的高度关注。据世界卫生组织和世界动物卫生组织统计，截止2007年8月底，H5N1禽流感疫情已波及亚洲、欧洲、非洲的44个国家，共计5200多起上报的案例；人类感染病例出现在12个国家，共计322例，死亡195人。随着禽流感疫情爆发的范围不断扩大，感染人数不断增加，全世界都在担忧H5N1病毒是否将在人群中大规模爆发，引起比SARS疫情更为严重的灾难。流感大流行需要具备3个条件：（1）必须形成一种新的流感病毒亚型；（2）必须导致人体感染并引起严重病症；（3）必须能在人群中轻易、持续地传播。目前H5N1病毒已经具备上面陈述的前两个条件，是一种新的高致病亚型，但是目前仍没有大规模人传人的证据。由此，高致病性与人际传染性是目前禽流感探讨领域中迫切需要解决的热点不足。本论文针对这两个热点不足，探讨H5N1高致病性的根本理由和人际传染性的基因序列特点。血凝素蛋白前体HA0裂解成两个亚单位HA1和HA2是病毒感染的必要条件。识别和切割HA0的酶有两类：胰蛋白酶类和碱性蛋白酶。能被哪类蛋白酶切割，则主要取决于HA0切割位点上游的氨基酸序列。蛋白酶在宿主细胞内的分布及血凝素蛋白的切割位点序列是影响禽流感病毒致病性的决定性因素。本论文以血凝素蛋白的切割位点与蛋白酶的相互作用出发，运用元胞自动机序列可视化模型、同源模拟和分子对接等策略，来揭示H5N1高致病的根本理由及其致病力的进化规律和方向，得到了以下结果：1.找到了H5N1-H5的特点基因片段，其翻译产物正好是血凝素蛋白的切割位点片段。不仅证明H5N1-H5具有不同于其它亚型病毒的独特的切割位点，也可以为H5N1的快速检测提供新的依据。我们通过元胞自动机基因序列可视化模型将HA的基因序列转化为图形，并在元胞自动机图上找到了H5N1-H5独有的图形特点，这个图形特点对应了一段位于1012bp左右，长度大约为30bps，主要由核苷酸‘A’和‘G’组成的特点基因片段。最普遍的特点基因片段为‘CAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGA’。将特点基因片段翻译后得到由多个碱性氨基酸组成的多肽片段，位于HA0的切割位点，是H5N1高致病性的决定性因素。2.对NCBI流感病毒数据库中的所有序列进行浅析，将有着的21种H5N1-H5切割位点突变类型按照碱性氨基酸的分布与个数分为6类，统计了它们在时间和地域上的分布情况，发现在时间上突变的比例逐年增加，切割位点的碱性氨基酸平均个数以7个逐渐下降到了6个；在地域上，突变类型大都集中在中国大陆和香港，而且有12种突变类型都起源于中国大陆和香港。3.用HA前体蛋白H1N1-H1的晶体结构作为模版，运用同源模拟的策略重建了H5N1-H5的三维结构，发现与低致病H1N1-H1相比，H5N1-H5的切割环更加舒展，切割位点更加暴露，非常有利于各种酶对其进行剪切。4.以分子水平上揭示了H5N1病毒的高致病机理，探讨了切割位点的各个子位点与蛋白酶的相互作用，发现P_1、P_2、P_4、P_6对高致病具有很大贡献。我们截取了高致病禽流感H5N1-H5切割位点的九肽片段‘RERRRKKRG’和低致病禽流感H1N1-H1切割位点的六肽片段‘SIQSRG’，采取分子对接的策略分别模拟它们被不同蛋白酶——只有着于呼吸道和消化道上皮细胞内的胰蛋白酶和几乎有着于所有细胞内的弗林蛋白酶切割的情况，并以蛋白酶的底物选择性揭示了H5N1的高致病性的理由，即胰蛋白酶对底物的P_1子位点有很强的选择性，S_1结合口袋的结构和性质，只允许带正电荷的精氨酸和赖氨酸的长侧链伸入，对于其它子位点并没有显示出选择偏好，由此胰蛋白酶既能够识别和切割低致病禽流感H1N1-H1切割位点的六肽片段，又能够切割高致病禽流感H5N1-H5切割位点的九肽片段；而弗林蛋白酶的底物选择性主要依赖于子位点P_1、P_2、P_4、P_6，弗林蛋白酶在活性部位富含酸性氨基酸，在多个亚部位（S_1、S_2、S_3、S_4、S_5、S_6、S_8）体现出对碱性氨基酸残基的偏好，特别是S_1、S_4和S_6，专为精氨酸设计，即使被置换为赖氨酸，也会导致结合自由能不同程度的减弱，由此弗林蛋白酶只能识别和切割高致病禽流感H5N1-H5切割位点的九肽片段，不能识别低致病禽流感H1N1-H1切割位点的六肽片段。5.以切割位点片段与弗林蛋白酶相互作用的结合自由能变化来评价H5N1病毒致病力的变化，发现致病力进化的规律及方向，即目前占主导地位的突变类型‘GERRRKKRG’、‘RESRRKKRG’和‘RERRRKRG’与弗林蛋白酶对接的结合自由能衰减幅度都很小，几乎不能对病毒的高致病性产生影响，但是如果‘GERRRKKRG’和‘RESRRKKRG’的碱性氨基酸继续发生突变，就会导致结合自由能减弱超过10kcal/mol，使病毒的致病力减弱。20世纪人类发生了3次流感大流行，分别由1918年的H1N1亚型、1957年的H2N2亚型、1968年的H3N2亚型病毒引起。探讨发现，1957年的H2N2和1968年的H3N2病毒的8个RN段中，有5个(PA、PB2、NP、MP和NS)都起源于1918年的H1N1病毒。可以认为，这5个片段中包含了共同的大流感基因序列特点。我们通过对三次大流感病毒的序列浅析找到了与大流感相关的33个特点位点，即PB2的199、475、567、627位点，PA的55、100、241、312、382、400、552、716位点，NP的16、100、136、283、313、357位点，M1的121位点，M2的14、16、20、78、86位点，NS_1的21、22、84、114、171、196、215、227、229位点。H5N1病毒在大部分特点位点都不具备大流感基因序列特点，与目前病毒尚不具备大规模人传人的能力的近况是相符的。大流感病毒H1N1和H3N2可能已经在进化历程中丧失了部分大流感基因序列特点，只有人流感病毒H2N2仍可能保留大流感基因序列特点。如果人流感病毒H2N2与禽流感病毒H5N1重组或者多种亚型病毒重组，产生的新病毒继承了人流感病毒PB2、PA、NP、MP、NS上的大流感基因序列特点和H5N1病毒HA的高致病性，那么就可能爆发新一轮的流感大流行。重组极有可能在“基因混合容器”猪体内发生，而中国农村的养殖及其生态环境为这种混合感染和病毒重组提供了理想的环境，我们要密切监控这些大流感特点位点，特别是与功能相关的这些位点的突变情况。关键词：H5N1论文血凝素论文高致病论文切割位点论文切割机制论文胰蛋白酶论文弗林蛋白酶论文结合自由能论文大流感基因序列特点论文基因重组论文
摘要3-6
ABSTRACT6-13
第一章 概述13-36
1.1 引言13-15
1.2 禽流感病毒的形态和结构15-16
1.3 禽流感病毒的基因组组成与编码蛋白质的功能16-24
1.3.1 血凝素(Hemagglutinin, HA)17-19
1.3.2 神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)19-20
1.3.3 聚合酶蛋白(Polymerase, PB2、PA 和 PB1)20-21
1.3.4 核蛋白(Nucleoprotein, NP)21-22
1.3.5 基质蛋白(Matrix Proteins, M1 和 M2)22-24
1.3.6 非结构蛋白(Nonstructural Proteins, NS1 和 NS2)24
1.4 禽流感病毒的致病性24-26
1.4.1 禽流感的病理特点24-25
1.4.2 H5N1 高致病禽流感的临床特点25-26
1.4.3 高致病禽流感的鉴定标准26
1.5 禽流感致病性的探讨近况26-32
1.5.1 HA 是禽流感病毒毒力的主要决定因素26-30
1.5.2 NA 对禽流感病毒的毒力有一定的作用30
1.5.3 PB2、PA、PB1 单个氨基酸的变化就可能导致流感病毒毒力很大的转变30-31
1.5.4 NS1 对于禽流感病毒在细胞水平上与宿主的相互作用起重要作用31
1.5.5 其它基因产物31-32
1.6 论文的目的与作用32-33
1.7 论文的主要探讨内容和革新点33-36
1.7.1 主要内容与安排33-34
1.7.2 革新点34-36
第二章 基于元胞自动机基因序列可视化模型的 H5N1-H5 基因序列浅析36-49
2.1 NCBI 流感病毒数据库36-37
2.2 元胞自动机37-40
2.2.1 元胞自动机的构成37-39
2.2.2 元胞自动机的特点39
2.2.3 初等元胞自动机39-40
2.3 基于初等元胞自动机的序列可视化模型40-43
2.3.1 核苷酸编码40-41
2.3.2 基因序列时空演化41-42
2.3.3 元胞自动机序列可视化模型运用于生物信息学42-43
2.4 基于元胞自动机基因序列可视化模型的 H5N1-H5 基因序列浅析43-48
2.4.1 第 216 号规则43-45
2.4.2 H5N1-H5 基因序列 CA 图的特点45-48
2.4.3 H5N1-H5 指纹的基因序列特点48
2.5 本章小结48-49
第三章 基于同源模拟的 H5N1-H5 切割位点结构浅析49-62
3.1 同源模拟(Homologous Modepng)49-50
3.2 序列比对(Apgnment)50-52
3.3 H5N1-Viet04 HA0 结构浅析52-58
3.4 H5N1-H5 切割位点片段的进化规律浅析58-61
3.5 本章小结61-62
第四章 基于蛋白酶底物选择性的 H5N1 高致病的根本理由及进化规律浅析62-95
4.1 分子对接62-67
4.2 蛋白酶67-74
4.2.1 丝氨酸蛋白酶(Serine)67-68
4.2.2 胰蛋白酶(Trypsin)68-71
4.2.3 弗林蛋白酶(Furin)71-74
4.3 不同切割位点片段与胰蛋白酶的对接模拟74-80
4.3.1 九肽‘RERRRKKR↓G’与胰蛋白酶的对接模拟74-78
4.3.2 六肽‘SIQSR↓G’与胰蛋白酶的对接模拟78-79
4.3.3 结论79-80
4.4 不同切割位点片段与弗林蛋白酶的对接模拟80-90
4.4.1 九肽‘RERRRKKR↓G’与弗林蛋白酶的对接模拟80-90
4.4.2 六肽‘SIQSR↓G’与弗林蛋白酶的对接模拟90
4.4.3 结论90
4.5 H5N1-H5 切割位点突变对高致病性产生的影响90-93
4.6 本章小结93-95
第五章 基于大流感基因序列特点的 H5N1 人际传染性探讨95-103
5.1 大流感基因序列特点95-99
5.2 H5N1 的人际传染性99
5.3 大流感病毒形成机制预测99-102
5.4 本章小结102-103
第六章 总结和展望103-107
6.1 本论文探讨总结103-105
6.1.1 元胞自动机在 H5N1-H5 基因序列特点提取中的运用103
6.1.2 H5N1-H5 三维结构的重建103-104
6.1.3 分子对接在分子水平上探讨 H5N1 高致病机理中的运用104
6.1.4 H5N1 高致病进化规律浅析及预测104
6.1.5 大流感基因序列特点的提取及大流感预测104-105
6.2 课题探讨展望105-107
6.2.1 生物实验的验证105
6.2.2 H5N1 血凝素蛋白切割位点与其它蛋白酶的相互作用105-107
H5N1-H5 序列信息列表（附录一）107-121
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