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【摘要】目的 探讨创伤弧菌脓毒症大鼠脑组织转位蛋白（TSPO）基因和蛋白表达及促/抗炎因子的蛋白表达，并观察抗菌药物头孢哌酮钠联合左氧氟沙星的干预效应。方法 SD大鼠100只，随机（随机数字法）分为健康对照组（A组，n=10）、创伤弧菌脓毒症组（B组，n=40）和抗菌药物干预组（C组，n=40），抗菌药物对照组（D组，n=10）。大鼠左后肢皮射创伤弧菌（6×108 cfu/ml，0.1 ml/100 g）制作脓毒症大鼠模型，腹腔注射头孢派酮钠180 mg/kg和左氧氟沙星18 mg/kg进行干预，以RT-PCR、Western blotting、免疫组化、ELISA等方法观察大鼠染菌后6、12、24、48 h脑组织TSPO表达、促/抗炎因子水平及电镜的特点。结果 与A组比较，B组大鼠脑组织TSPO表达水平6 h即明显增高（P<0. 05），24 h达峰值。C组大鼠12、24、48 h 脑组织TSPO表达水平均明显低于相同时间点B组大鼠（P<0.05）。B组大鼠脑组织各时间点TNF-α、IL-6、IL-10水平均比A组明显升高（P<0.05），其中TNF-α在6 h达峰值，IL-6 12 h达峰值， IL-10则48 h达峰值。与B组相同时间点比较，C组大鼠6、12、24 h时点脑组织TNF-α水平明显下降（P<0.05），12、24、48 h时间点脑组织IL-6水平亦明显下调（P<0.05），而IL-10水平在各时间点均较B组明显升高（P<0.05）。免疫组化法观察B组大鼠脑组织TSPO蛋白棕颗粒密集较多，C组棕颗粒较B组减少；电镜下B组大鼠脑组织神经元细胞核溶解消失，细胞及细胞器肿胀明显，C组大鼠脑组织神经元细胞核部分溶解，形态尚存，细胞及细胞器水肿减轻。结论 创伤弧菌脓毒症大鼠脑组织TSPO的表达随着脑组织炎症、病理进展逐渐增高，能敏感反映脑损伤的变化。使用头孢哌酮钠和左氧氟沙星能有效减轻脑组织炎症损伤，降低TSPO的水平。【关键词】创伤弧菌；脓毒症脑病；转位蛋白；抗菌药物；大鼠
TSPO expression in brain tissue of vibrio vulnificus sepsis rats and the effects of antibacterial agents HONG Guang-liang， DAI Xiao-qin，XIANG Lan，LU Zhong-qiu， ZHAO Guang-ju， WU Bin， LI Meng-fang， ZHANG Chun-wu. Emergency Medical Department， The First Affiliated Hospital， Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000， China
Corresponding author： ZHANG Chun-wu，Email：zcw6681@12
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【Abstract】Objective To investigate the potential role and changes of translocator protein 18 kDa （TSPO） in brain tissue of vibrio vulnificus（VV）septic rats and effects of Cefoperazone Sodium combined with Levofloxacin. Methods One hundred SD rats were divided randomly（random number） into four groups：normal control group （A， n=10）， VV sepsis model group （B，n=40）， antibiotics treatment group （C， n=40）， and antibiotics control group （D， n=10）. Septic model was replicated byinjection with VV （6×108 cfu/ml， 0.1 ml/100 g）in the left posterior leg of rats. The antibacterials were given intraperitoneally with Cefoperazone sodium（180 mg/ kg） combined with Levofloxacin（18 mg/kg）. The level of TSPO and pro- and anti-Inflammatory cytokines in rattish brain at 6， 12， 24， 48 h after infection were observed by RT-PCR， Western blotting， immunohistochemisty and ELISA. Then pathological change in brain tissue was detected by electron microscope.Results Compared with group A， the expression of TSPO in brain tissue was significantly increased in group B （P<0.05）， and reached the peak at 24 h. The TSPO expression in group C was significantly decreased compared with that in group B at 12， 24， 48 h （P<0.05）. The levels of TNF-α， IL-6， IL-10 in brain tissue of group B were significantly higher than those in group A （P<0.05）. Compared with group B， the TNF-α expression in group C was siginificantly decreased at 6， 12， 24 h （P<0.05）， while the IL-6 expression was siginificantly decreased at 12， 24， 48 h （P<0.05） and IL-10 level was significantly increased at 6， 12， 24， 48 h （P<0.05）. Immunohistochemical tests showed brownish yellow particles（TSPO protein） in the brain tissue of group B were more dense than those in group C. Electron microscope showed the nerve cells and organelles were swelling intensively and the neuronal nucleus were dissolved and disappear in group B. But the neuronal nucleus were dissolved partly and the swelling were alleviative in group C. Conclusions TSPO expression is markedly increased in accord with brain tissue injury and inflammation， which makes it suited for assessing brain injury as a sensitive biomarker in VV sepsis. Effective antibiotics can inhibit the inflammatory and injury and reduce the level of TSPO in septic brain.源于：论文格式范文www.udooo.com
1.4.4 免疫组化法检测并观察大鼠脑组织TSPO的表达 石蜡组织切片常规脱蜡，梯度水化，3%H2O2室温封闭，抗原修复，5%BSA封闭，一抗孵育4 ℃过夜，二抗孵育，滴加SABC，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，光镜下观察。1.4.5 ELISA法检测大鼠脑组织TNF-α、IL-6、IL-10蛋白的表达 取待测大鼠脑组织100 mg，按脑湿质量与生理盐水比例为100 mg∶1 ml，玻璃匀浆器匀浆，取匀浆液，4 ℃，3000 r/min，离心15 min取上清，按照TNF-α，IL-6，IL-10 ELISA试剂盒中步骤严格操作，结果测定采用芬兰Thermo公司生产的酶标仪（型号：DENLEY DREGON Wellscan MK3）以Ascent software for Multiskan软件进行分析。
1.4.6 透射电镜下观察脑组织超微结构 电镜下观察A组脑组织超微结构，以A组为参照，观察B组24 h、C组24 h、D组脑组织的超微结构。
1.5 统计学方法 所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 13.0进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠脑组织TSPO的表达及抗菌药物的影响
A、D两组比较，TSPO基因、蛋白表达差异无统计学意义。与A组比较，B组各时间点大鼠脑组织TSPO mRNA及蛋白表达均明显升高（P<0.05），24 h达峰。与D组比较，C组6、12、24 h大鼠脑组织TSPO mRNA及蛋白表达明显升高（P<0.05）。与B组相应时间点比较， C组12、24、48 h时点大鼠脑组织TSPO mRNA及蛋白表达明显降低（P<0.05）。见表2，图1和图2。2.2 免疫组化法检测结果 采用免疫组化法检测观察创伤弧菌大鼠脑组织TSPO的表达及抗菌药物的影响。光镜下观察TSPO免疫组化结果，A组和D组大鼠脑组织无明显差别（图3A、 D），B组24 h可见团状脑组织液化，棕灰色颗粒较多（图3B），C组24 h大鼠脑组织可见少量点状液化灶，棕灰色颗粒较B组24 h明显减少（图3C）。
2.3 大鼠脑组织TNF-α、IL-6、IL-10蛋白变化
A、D两组比较，TNF-α、IL-6、IL-10蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与A组比较，B组大鼠脑组织各时间点TNF-α、IL-6、IL-10水平均明显升高（P<0.05），其中TNF-α在6 h即达峰值，随后逐渐回落，而IL-6水平12 h达峰值， IL-10水平在48 h达峰值。C组TNF-α、IL-6、IL-10水平明显高于对照组，其变化趋势基本与B组相同。与B组相同时间点比较，6、12、24 h时点 C组大鼠脑组织TNF-α水平明显降低，12、24、48 h时点脑组织IL-6水平亦明显下调，而脑组织IL-10水平在各时间点均较B组明显升高（P<0.05）。见表3。2.4透射电镜下观察脑组织超微结构
透射电镜下大鼠脑组织超微结构，健康对照组（A组）大鼠脑组织神经元细胞核形态正常，较大，偏位，常染色体多，胞浆内有分泌颗粒和游离核糖体及粗面内质网及溶酶体（图4A）。D组较A组差别不大（图4D）。B组24 h大鼠脑组织神经元细胞核溶解消失，核内及胞浆间质水肿明显，游离核糖体显著减少，线粒体消失，粗面内质网明显扩张，整个细胞密度稀疏（图4B）；C组24 h大鼠脑组织神经元细胞核变形，部分溶解，但形态尚存，细胞水肿较B组减轻，胞浆内细胞器的损伤程度较B组明显减轻，整个细胞密度较B组密集（图4C）。3 讨论
创伤弧菌脓毒症在沿海地区散发，起病急，进展迅速，常并发肝、肾、脑等多脏器功能不全，病死率高达50%～70%［7］，早期应用敏感抗菌药物联合外科切开减张能改善患者预后［8-9］。本研究以创伤弧菌注射大鼠后肢构建创伤弧菌脓毒症模型，脑组织炎症反应明显增高，同时电镜观察到大鼠脑神经细胞
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肿胀，密度稀疏十分明显，神经元细胞核溶解，线粒体消失，粗面内质网扩张等，与SE患者尸检所见的脑实质损伤相近［10］，提示本研究中脓毒症脑损伤模型构建成功。神经胶质细胞作为中枢神经系统重要的执行免疫监视和宿主防御功能细胞，其活化被认为是中枢神经系统微环境变化最敏感的标志［11］。TSPO，原名为外周型苯二氮卓受体（PBRS），在中枢集中分布于神经胶质细胞的线粒体外膜上，参与调节胶质细胞的增殖、分化、免疫、吞噬及凋亡等［12-13］。最近研究发现TSPO在静息的胶质细胞中表达很低，而在胶质细胞激活后呈现明显高表达［14］，提示TSPO的表达是反映各种病理状态下胶质细胞活化程度的生物学指标，这为TSPO作为反映脓毒症脑损伤的敏感指标提供了理论可能。
SE发病是脓毒症全身炎症反应在中枢神经系统局部的表现，过度炎症反应、血管内皮损伤、缺血缺氧等病理生理反应必将导致脑内微环境的改变，导致神经胶质细胞迅速激活，并释放多种细胞因子及毒素，介导并加重脑组织的损害，同时伴随着TSPO的过度表达。本研究也证实，创伤弧菌脓毒症大鼠脑组织早期即可出现TSPO的高表达，并随着病情进展持续增高，与脑组织炎症反应及病理损伤程度具有很好的一致性。而且TSPO表达在脓毒症6 h即可明显升高，早于脑组织明显的病理改变。可见，脓毒症脑损伤致病中，神经胶质细胞的活化发挥了重要作用，而TPSO表达是反映脓毒症脑损伤的敏感指标。有研究利用TSPO配体PK 11195（PBR的拮抗剂）拮抗TSPO效应，能降低小鼠体内促炎因子的表达，减轻脑损伤，显示了良好的抗炎作用［15-16］。提示TPSO不仅是反映脓毒症损伤的生物学指标，而且可能参与脓毒症损伤的致病过程，通过拮抗或下调TPSO的表达可能是治疗脓毒症脑损伤的潜在靶点。研究结果表明，抗菌药物干预能明显下调TSPO的表达，其原因可能与抗菌药物能有效抑制细菌倍增，从源头减轻炎症反应，减少神经胶质细胞的活化与脑损伤有关，提示敏感抗菌药物能有效地干预创伤弧菌脓毒症脑损伤。
本研究中采用头孢哌酮钠和左氧氟沙星干预能明显增加大鼠脑组织IL-10的水平，有效抑制炎症反应。其机制尚不明确。推测可能与抗菌药物参与调控机体免疫功能有关［17-19］。Purswani等［20］研究表明，给予环丙沙星预处理能明显降低脓毒症小鼠体内的TNF-α和IL-12水平，提高IL-10水平，从而改善小鼠存活率。Ci等［21］研究发现，预先给予头孢噻呋也具有类似的作用，能明显降低脓毒症小鼠体内TNF-α、IL-1β 、 IL-6水平，增高IL-10水平。由此可见，头孢类药物及氟喹诺酮类抗菌药物不仅可以直接杀灭细菌，而且能调节机体的免疫［22］。但目前尚无直接证据支持头孢哌酮钠和左氧氟沙星也具有免疫调节的作用，故有待进一步研究。
综上所述，本研究结果证实创伤弧菌脓毒症大鼠脑组织TSPO表达在早期即明显升高，是反映脑损伤的敏感指标。不仅如此，TSPO极可能也参与调节脓毒症脑损伤的病理生理过程。应用敏感抗生素干预后能有效下调TSPO表达，减轻脓毒症脑损伤。
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