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摘要：产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的K88菌毛是强劲的免疫原性抗原能够诱发机体产生保护性免疫。FaeG是K88菌毛的主要蛋白亚基,对于K88(+)ETEC引起的仔猪腹泻具有良好的免疫保护效果。本探讨以ETEC中PCR扩增出FaeG基因,并融合36个碱基的树突状细胞诱导肽(DCpep),连接pSIP-409载体,使其分别在大肠杆菌和乳酸杆菌中获得表达,将重组乳酸菌灌胃BALB/c小鼠,取得了良好的免疫效果。本探讨根据GenBank上发表的K88菌毛的FaeG基因序列,设计一对带有Kpn Ⅰ和HindⅢ酶切位点的引物,以购自中国兽医药品监察所的ETEC质粒中PCR扩增出FaeG基因,全长846bp,包含了FaeG基因完整的开放阅读框,并引入了包含36个碱基的DCpep与FaeG基因融合,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a中提取质粒。经PCR, Kpn Ⅰ、HindⅢ酶切鉴定及序列测定浅析,结果表明成功克隆了FaeG基因,并融合了DCpep, BLAST浅析结果显示与GenBank上发表的K88菌毛的FaeG基因序列的相似性达到99%。将FaeG-DC基因克隆至大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP-409中,转化至大肠杆菌BL21中,经鉴定表明成功构建了重组表达质粒pSIP-409-FaeG-DC。经SppIP诱导肽诱导,SDS-PAGE检测和Western blot浅析表明,在32kDa处有显著的目的蛋白条带,FaeG-DC在大肠杆菌中成功表达,且反应原性良好。采取电转化策略将重组质粒pSIP-409-FaeG-DC转化至植物乳杆(Lb.plantarum NC8)中,经SDS-PAGE检测和Western blot浅析表明,在32kDa处有显著的目的蛋白条带,FaeG-DC在乳酸菌中成功表达,且反应原性良好。用pSIP-409-FaeG-DC重组乳酸菌灌胃6周龄的BALB/c小鼠,每周3次,灌胃2周,灌胃剂量提升2倍,连续灌胃4周。间隔2周,攻菌ETEC,1周后将小鼠处死。每周对小鼠称重,尾静脉采血并分离血清,采取ELISA策略检测攻菌ETEC前、后小鼠血清中IgG的变化以及攻菌后肠内容物中的sIgA。采取流式细胞仪检测细胞因子IL-12、TNF、IL-4、IL-10、B细胞CD19+以及树突状细胞CD11C+的数量,通过SPSS17.0软件对以上数据进行浅析比较,并观察小鼠结肠病变程度。结果表明重组乳酸菌pSIP-409-FaeG-DC产生了良好的免疫效果。本实验将ETEC的FaeG基因融合DCpep在乳酸菌中成功表达,灌胃BALB/c小鼠后,免疫效果良好,为研制预防仔猪大肠杆菌腹泻的基因工程乳酸菌口服制剂奠定了基础。关键词：ETEC论文FaeG基因论文乳酸菌论文免疫效果论文
摘要5-6
Abstract6-9
第一章 前言9-17
1.1 仔猪大肠杆菌腹泻9-12
1.2 乳酸菌的表面结构与粘附特性概述12-15
1.3 树突状细胞及其诱导肽15-16
1.4 探讨的目的和作用16-17
第二章 产肠毒素大肠杆菌FaeG-DC基因的克隆与序列浅析17-26
2.1 材料17-19
2.2 策略19-21
2.3 结果21-25
2.4 讨论25
2.5 小结25-26
第三章 重组表达载体的构建及其在大肠杆菌和乳酸菌中的表达26-40
3.1 材料26-29
3.2 策略29-32
3.3 结果32-38
3.4 讨论38-39
3.5 小结39-40
第四章 产肠毒素大肠杆菌FaeG-DC基因重组乳酸菌免疫效果检测40-57
4.1 材料40
4.2 策略40-43
4.3 结果43-55
4.4 讨论55-56
4.5 小结56-57
第五章 结论57-58