摘要：1型糖尿病(type1diabetes,T1D)是一种针对胰腺胰岛p细胞的自身免疫性疫病,其结果是导致胰岛素分泌缺乏。自身反应性抗体和T淋巴细胞的出现、T细胞介导的疾病过继转移性以及对免疫抑制治疗的敏感性是T1D自身免疫性的集中体现。在该疾病的发生历程中,胰岛素(insupn, Ins)、胰岛素其前体、谷氨酸脱羧酶等是其主要自身抗原。1口服家蚕表达的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记的霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit, CTB)与人胰岛素融合蛋白治疗1型糖尿病的探讨口服一种疾病特异的自身抗原可诱导机体对该疾病产生免疫反应的耐受,以而抑制或延缓该自身免疫性疾病的进展。在机体内有效诱导免疫耐受需要长期的口服大剂量的特异蛋白抗原,而CTB是诱导口服免疫耐受的强有力的粘膜佐剂分子,可开发用来偶联抗原蛋白大大减少抗原蛋白的口服耐受诱导利用剂量,提示CTB偶联自身抗原Ins诱导口服耐受防治T1D可能具有实际的治疗作用和潜在的运用前景。在本探讨中我们构建了GFP标记的CTB与人Ins融合基因,并利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达该蛋白,该融合蛋白(48kDa)在家蚕幼虫的血淋巴中表达量达到0.58mg/ml。经验证,该融合蛋白在家蚕中以五聚体形式有着,并且保持与神经节苷脂GM1的结合特性以及CTB和Ins的抗原性。非肥胖性糖尿病(non-obese diabetes,NOD)小鼠口服微克级的含此融合蛋白的蚕血淋巴,胰腺的组织病理切片显示胰岛发炎程度显著减轻,适时监测血糖的实验结果亦表明T1D的发病显著延缓。这些结果表明家蚕生物反应器是一个理想的口服疫苗生产系统,并且口服通过该生产系统表达的蛋白可诱导对T细胞介导的某些自身免疫疾病的耐受,在该方向上的科学探讨利用我国自身蚕业资源的优势探讨T1D的口服治疗疫苗,为T1D的治疗提供了新的切入点。2.口服胰岛素治疗T1D的作用机制与特异性调节性T (regulatory T, Treg)细胞的相关性探讨粘膜诱导的免疫耐受在治疗自身免疫性疾病中极具进展前景。文献报道,通过鼻腔粘膜,舌下腺或小肠粘膜诱导的特异性耐受与Treg细胞有关,尤其在小肠内抗原蛋白经山树突状细胞提呈给免疫细胞,可能诱导出适合Treg产生的环境,通过抗原特异性Treg细胞的诱导发挥免疫抑制作用,相类似的作用在肿瘤浸润历程中也得到证实。在本实验探讨中,我们构建的GFP标记的CTB与人Ins融合蛋白与本实验室已有的CTB-INS融合蛋白均可诱导Ins特异的口服耐受。利用GFP标签我们追踪到融合蛋白可与小肠粘膜发生特异性结合。在小鼠血液中,我们检测到抗CTB、Ins的特异抗体亚型IgG1抗体水平升高,同时脾脏、小肠淋巴结、血液中CD4+CD25+Foxp3+T细胞与对照组相比显著增加。而脾脏淋巴细胞的增值和迁移能力受到抑制提示此融合蛋白诱导的口服耐受与特异性Treg的产生相关。NOD/SCID小鼠过继转移实验表明口服耐受诱导产生了免疫抑制性淋巴细胞。这些结果提示,在治疗T1D的历程中,口服GFP、CTB与人Ins融合蛋白通过小肠粘膜诱导的免疫耐受在外周免疫系统中上调了特异性Treg细胞,此抑制性免疫细胞可能通过抑制其它免疫细胞的生物学功能发挥其在胰岛素依赖的糖尿病治疗中的作用。这些结果提示,口服胰岛素可能是治疗T1D的一种有效并且可行的治疗对策,而口服耐受有望成为治疗自身免疫性疾病的新策略、新途径。关键词：1型糖尿病论文霍乱毒素B亚基论文胰岛素论文绿色荧光蛋白论文杆状病毒表达系统论文家蚕论文口服耐受论文
致谢3-4
目次4-7
缩写表7-10
中文摘要10-12
英文摘要12-14
第一章 综述14-32
1.1 1型糖尿病的发病理由14-16
1.1.1 遗传因素14-15
1.1.2 环境因素15
1.1.3 自身免疫因素15-16
1.2 1型糖尿病的发病机理16-19
1.2.1 自身抗原16-17
1.2.2 免疫细胞17-18
1.2.3 细胞因子18-19
1.3 1型糖尿病的治疗19-20
1.4 服耐受治疗自身免疫性疾病20-27
1.4.1 口服耐受的发现20
1.4.2 口服耐受的运用20-22
1.4.3 口服耐受的诱导机制22-24
1.4.4 生物体内的免疫耐受网络24-27
1.4.5 口服耐受的诱导瓶颈27
1.5 免疫佐剂CTB27-29
1.5.1 CTB的分子结构27-28
1.5.2 CTB的运用28-29
1.6 家蚕杆状病毒蛋白表达系统29-30
1.6.1 家蚕杆状病毒表达系统的特点29-30
1.6.2 家蚕杆状病毒表达系统的运用30
1.7 示踪分子GFP30-32
1.7.1 GFP的特点30-31
1.7.2 GFP的运用31-32
第二章 实验案例设计32-35
2.1 实验目的与作用32-33
2.2 探讨内容33-34
2.2.1 GFP、CTB与人Ins重组家蚕杆状病毒的构建与活力检测33
2.2.2 CTB-Ins-GFP融合蛋白的表达及口服治疗1型糖尿病的作用探讨33
2.2.3 口服家蚕表达的融合蛋白治疗1型糖尿病的机理探讨33-34
2.3 实验案例设计34-35
第三章 重组杆状病毒的获得与活力检测35-58
3.1 引言35-36
3.2 实验材料与策略36-48
3.2.1 实验材料36-38
3.2.2 实验策略38-48
3.3 实验结果与浅析48-58
3.3.1 获得CTB、CTB-Ins、GFP片段48-49
3.3.2 构建CTB-GFP、CTB-Ins-GFP融合基因49-51
3.3.3 构建包含CTB-GFP、CTB-Ins-GFP融合基因的Bacmid载体51-53
3.3.4 获得重组病毒53-56
3.3.5 重组病毒的活力检测56-58
第四章 融合蛋白的表达与治疗1型糖尿病的作用探讨58-78
4.1 引言58
4.2 实验材料与策略58-64
4.2.1 实验材料与试剂58-61
4.2.2 实验策略61-64
4.3 实验结果与浅析64-78
4.3.1 荧光显微镜检测融合蛋白表达64-65
4.3.2 ELISA浅析融合蛋白表达65-69
4.3.3 Western Blot鉴定融合蛋白表达69-71
4.3.4 GM1结合ELISA检测蛋白活性71-73
4.3.5 胰腺损伤浅析73-74
4.3.6 体液免疫反应浅析74-75
4.3.7 治疗T1D的效果浅析75-78
第五章 融合蛋白诱导的口服耐受与调节性T细胞78-98
5.1 引言78
5.2 实验材料与策略78-82
5.2.1 实验材料与试剂78-79
5.2.2 实验策略79-82
5.3 实验结果与浅析82-98
5.3.1 实验结果82-95
5.3.2 结果浅析与讨论95-98
结论98-100
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