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摘要：Ⅰ型糖尿病(T1D)是一种器官特异性自身免疫性疾病。其发病机制复杂,病程早期胰岛内出现细胞浸润,进而导致胰岛炎,在大量胰岛β细胞遭到破坏后,患者出现胰岛素缺乏及糖代谢失调。抗原特异性CD8+T淋巴细胞可以识别胰岛β细胞表面由MHC-Ⅰ类分子递呈的自身抗原肽,通过分泌穿孔素和颗粒酶等机制发挥细胞毒作用,以而破坏胰岛β细胞。Irsupn抗原在这个历程中起一个关键点甚至触发抗原的作用。由此,对这部分CD8+T淋巴细胞监测和清除,对于T1D的诊断和治疗具有非常重要的作用。四聚体技术是CD8+T淋巴细胞定量检测的金标准,但传统MHC-Ⅰ四聚体制备流程繁琐,而且亲和力低的抗原肽很难与MHC-Ⅰ重链和轻链分子形成稳定的MHC-Ⅰ单体。由此,我们引入MHC-I单链三聚体技术(single chain trimer,SCT)将InsupnB15-23抗原肽,MHC-Ⅰ类分子重链和轻链用接头(pnker)依次连接成一个整体,提升抗原肽与MHC分子的稳定性。此外,为获得与InsupnB15-23特异性CD8+T细胞结合能力更强的靶向分子,我们引入了G9V和Q115E两处改善。一、制备InsB15-23H-2Kd-SCT四聚体本探讨中,我们首先利用基因工程技术获得了pET22b-InsB15-23H-2Kd-SCT、pET22b-Ⅰ nsB15-23G9vH-2Kd-SCT(G9V改造)、pET22b-InsB15-23H-2KdQ115E-SCT(Q115E改造)；pET22b-InsB15-23G9vH-2KdQ115E-SCT(G9V和Q115E双改造)四种原核表达载体,并通过洗涤获得包涵体蛋白。接着我们利用pET22b载体中的6×His tag对四种Ins-SCT包涵体蛋白进行纯化,通过稀释复性使其恢复天然构象。其后,我们进一步对复性的四种重组蛋白进行生物素化,并与PE标记的链霉亲和素按适当比率共孵育,制得Ins-SCT四聚体。最后,我们通过流式细胞技术对四种Ins-SCT四聚体进行了鉴定,同时采取商品化InsB15-23H-2Kd五聚体作为阳性对照。二、InsB15-23H-2Kd-SCT真核表达质粒体内诱生特异性CTL为了检测InsB15-23H-2Kd-SCT结构的正确性,我们同时构建一个具有全长H-2Kd的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-InsB15-23H-2Kdfull length-SCT,免疫NOD小鼠,试图在NOD小鼠体内诱生InSB15-23自身反应性CD8+T细胞,然后用商品化的InsB15-23H-2Kd-SCT五聚体对其进行检测。结果表明pcDNA3.1-β2m-InsB15-23H-2Kdfull length-SCT能成功地诱生InsB15-23特异性CD8+T细胞。三、四种InsB15-23H-2Kd-SCT四聚体的性能比较比较四种InsupnB,5-23H-2Kd-SCT四聚体和InsB15-23特异性CD8+T细胞的结合能力,发现这四种SCT四聚体均能结合InsupnB15-23特异性CTL,且仅有很低的非特异性结合率其中双改造的PE-InsB15-23G9vH-2KdQ115E-SCT四聚体的特异性结合能力最强,最合适用于检测InsB15-23特异性CD8+T细胞。和商品化的InsB15-23H-2Kd五聚体相比,我们利用InsB15-23G9vH-2Kd Q115E-SCT制备的四聚体的性能更加优越。关键词：Ⅰ型糖尿病论文InsupnB_(15-23)论文H-2K~d论文单链三聚体论文特异性CD8~+T细胞论文
中文摘要4-6
Abstract6-8
符号说明8-10
前言10-14
-353. 结果35-41
4. 讨论41