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摘要：目的：运用稳定过表达GLUT4myc的能收缩的C2C12GLUT4myc小鼠骨骼肌细胞探讨PKC异构体在收缩刺激骨骼肌细胞GLUT4转位机制中的作用。策略：第一部分在前期工作基础上,运用免疫印迹(Western blot)策略检测氨乙酰胆碱(Carbachol)对蛋白激酶C(PKC)磷酸化的影响。并运用PKC的特异性药物抑制剂BIM-I (bisindolylmaleimide I)、Go6983、Ro-31-8425和Go6976预孵育C2C12GLUT4myc小鼠骨骼肌细胞,酶联免疫吸附试验(enzyme-pnked immnosorbent assay,ELISA)测定Carbachol刺激的GLUT4myc转位,探讨c/nPKC是否参与收缩刺激骨骼肌细胞GLUT4myc转位的作用。第二部分在上面陈述的工作基础上,分别运用PKC8的特异性抑制剂Rottlerin, PKCε的抑制肽(Myr-ESLKPT)和PKCδ的抑制肽(Myr-NSYELGSL)预孵育C2C12GLUT4myc小鼠骨骼肌细胞,ELISA策略测定Carbachol刺激的GLUT4myc转位作用,进一步探讨何种PKC异构体参与收缩刺激的骨骼肌细胞GLUT4myc转位作用。结果：我们的前期工作发现,C2C12GLUT4myc肌管响应浓度为0.1～1mM Carbachol的刺激。Carbachol升高C2C12GLUT4myc骨骼肌细胞胞浆的钙离子浓度,并增加细胞表面GLUT4myc含量。本探讨第一部分Western blot结果显示,在C2C12GLUT4myc肌管中Carbachol增加PKC的磷酸化水平。ELISA检测结果显示,0.1mM Carbachol刺激15min可增加C2C12GLUT4myc肌管的GLUT4myc转位。在不影响基础值的情况下,1pM BIM-I和Go6983(二者均为cPKC和nPKC的抑制剂)分别抑制72.7%和56.0%Carbachol刺激的GLUT4myc转位(p0.05),1μM和3μM的Ro-31-8425分别抑制41.7%和54.4%Carbachol刺激的GLUT4myc转位(p0.05)；同时我们还发现,1μMGo6976(cPKC的抑制剂)对Carbachol刺激的GLUT4myc转位没有抑制作用。第二部分运用不同PKC异构体的抑制剂和抑制肽孵育C2C12GLUT4myc肌管,结果显示：Carbachol增加C2C12GLUT4myc肌管的GLUT4myc转位。在不影响基础值的情况下,浓度为3μM和10μM的Rottlerin对Carbachol刺激的GLUT4myc转位均没有抑制作用(p0.01)。然后,我们运用浓度为3μM的PKCs的抑制肽和PKCδ的抑制肽进行进一步验证,结果发现,浓度为3μM的PKCε的抑制肽可抑制61.8±0.09%(P0.01)Carbachol刺激的C2C12GLUT4mmyc肌管GLUT4myc转位,而浓度为3μM的PKCδ的抑制肽则不影响Carbachol刺激的GLUT4myc转位。结论：1.在C2C12GLUT4myc肌管中Carbachol增加PKC的磷酸化水平,说明PKC响应Carbachol的刺激而被激活。2. cPKC和nPKC的三种抑制剂BIM-I、GO6983和Ro-31-8425均抑制Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc转位,而cPKC的抑制剂Go6976则对此转位没有抑制作用,说明nPKC参与Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc转位,而cPKC则可能不参与此转位作用。3. PKCδ的抑制剂Rottlerin对Carbachol刺激的GLUT4myc转位没有抑制作用,提示PKCδ异构体可能不参与Carbachol刺激的GLUT4myc转位；PKCs的抑制肽抑制Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4mvc转位,提示PKCs异构体参与Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc转位；与Rottlerin结果相一致,PKCδ的抑制肽不抑制Carbachol刺激的GLUT4myc转位,进一步提示PKCδ可能不参与Carbachol刺激的GLUT4myc转位作用。关键词：PKC论文骨骼肌论文收缩论文葡萄糖转运子4论文转位论文
中文摘要4-6
Abstract6-9
符号说明9-11
前言11-19
探讨近况、成果11-16
探讨目的、策略16-19
一、c/nPKC是否参与收缩刺激的GLUT4myc转位作用19-35
1.1 材料19-24
1.2 策略24-26
1.3 结果26-33
1.4 小结33-35
二、何种PKC异构体参与收缩刺激的GLUT4myc转位作用35-42
2.1 材料35-37
2.2 策略37-38
2.3 结果38-41
2.4 小结41-42
讨论42-47
结论47-48