摘要：微管广泛有着于真核细胞的胞质内,是由αβ两种微管蛋白聚合而成的管状聚合物。作为构成细胞骨架的主要成分之一,微管在维持细胞形态,参与细胞的收缩和胞质内物质的运输等方面发挥着重要的作用。尤其是其在细胞分裂前期解聚重组形成纺锤体参与到细胞有丝分裂中的这一特殊的生物学功能使之成为抗肿瘤药物的重要靶点。肿瘤细胞具有快速增殖的能力,若抑制其纺锤体的形成,必将影响细胞有丝分裂的正常进行,使得肿瘤细胞生长停滞于G2/M期。二十世纪初以微管为靶点的紫杉醇类药物在临床上的成功运用激起了人们寻找和改造新型微管类靶点药物的浓厚兴趣。尽管人们对紫杉醇不断地进行结构改造和修饰但其水溶性差,易产生多药耐药以及毒副作用强等不足还是限制了其临床上的广泛运用。寻找新型的微管靶点药物一直是抗肿瘤药物学领域探讨的热点之一,直到1987年美国国家癌症探讨所Pettit等以南非矮生柳树(Combretum caffrum)中发现了天然活性产物combretastatin A-4(CA-4)。作为经典的微管聚合抑制剂秋水仙碱的类似物,CA-4还具有较强的破坏肿瘤血管的作用。因而与传统的微管类药物相比,CA-4具有抗癌效果强,不易产生耐药等诸多优点,而且由于其结构新颖,便于改造和修饰,颇受药物探讨者的青睐。然而随着CA-4临床试验的深入,人们发现CA-4虽然能导致肿瘤细胞的大量坏死,但对残存的肿瘤组织的杀伤力较弱,因而常导致化疗的失败。本论文的探讨旨在寻找一些新的CA-4的衍生物以及开发CA-4的临床运用潜能,探讨常规的化疗药物或是临床一线用药与CA-4合理的联合用药案例,以期通过以上两方面的探讨达到减少用药量,增强药物疗效并减轻化疗药物的毒副作用的最佳治疗效果。同时对限制CA-4抗肿瘤疗效的分子机制做了进一步的探讨,希望能为制定该类化合物临床治疗对策提供全新的思路。本论文将主要分为以下三个部分：(1)对经过结构改造和修饰得到的一系列CA-4衍生物进行抗肿瘤活性的筛选以及相应的药效学评价,并对以中得到的抗肿瘤活性较好,并且毒副作用较低的候选化合物进行初步分子机制的探讨。(2)寻找合理的联合配伍用药案例,将不同作用机制的抗肿瘤药物与CA-4合用,以期达到减少药物用量,提升疗效,减轻化疗药物的毒副作用的最佳效果。并进一步探讨两药合用的分子机制,力求为设计临床联合治疗案例提供新的方向。(3)为进一步推动CA-4的临床运用,解决其不能有效抑制化疗后残存的肿瘤细胞增殖的现象,我们对其抗肿瘤机制做了深入的探讨,希望通过寻找限制CA-4抗肿瘤疗效的分子机制,采取相应的措施有针对性的进行克服。第一部分Combretastatin A-4衍生物的抗肿瘤活性及其机制的探讨目的：作为新型的微管聚合抑制剂,CA-4由于其结构简单,抗癌活性显著,因而备受药物化学家的关注。为进一步提升其疗效,降低毒性,我们通过对一系列经过修饰的CA-4衍生物抗癌活性的筛选,旨在寻找具有广谱抗肿瘤活性的新型CA-4类化合物。策略和结果：XN05是一个新合成的Combretastatin A-4的类似物。首先我们通过MTT法在六株不同组织来源的人肿瘤细胞上(SGC、PC-3、ECA、MCF-7A2780和A549)对XN05的抗肿瘤活性进行细胞水平检测。结果显示其具有较强的抗肿瘤活性,IC5o值均小于2μM,而在两株肝癌细胞BEL-7402和MC-7721上的抗肿瘤活性比CA-4更强。值得注意的是,在正常的肝实质细胞HL-7702上XN05的IC50值要显著高于CA-4,提示我们该化合物对正常组织来源的细胞杀伤作用相对较弱。进一步通过离体的微管蛋白聚合实验和免疫荧光实验的结果证实XN05也是以微管为靶点发挥其抗肿瘤活性,并且XN05抑制微管聚合的能力与其母体CA-4类似。引起细胞G2/M期阻滞是微管类药物的重要特点之一,运用流式细胞术在经过XN05处理的两株肝癌细胞中均能观察到显著的G2/M期细胞周期阻滞现象,并且该现象有着浓度和时间依赖性。Western blot结果显示XN05引起的G2/M期阻滞现象也可能与细胞周期关键蛋白cdc2, CDK7以及cycpn B1的表达发生异常有关。随着药物作用时间的延长我们发现处于G2/M期阻滞的细胞最终走向了细胞的凋亡,进一步地肿瘤细胞的生长受到了抑制。结论：本探讨表明经过结构修饰的新型CA-4衍生物XN05具有明确的作用靶点,通过抑制微管的聚合使得细胞阻滞在G2/M期,并最终导致细胞走向凋亡发挥其抗肿瘤活性。此外,我们还发现XN05作用于BEL-7402和MC-7721肝癌细胞后引起的不同程度细胞周期阻滞可能与XN05能够对不同的周期蛋白(Cycpns)及周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的表达产生影响相关。XN05在体外有着广谱,且优于同系列化合物的抗肿瘤活性,尤其是其在肝癌细胞株中体现出的细胞毒特异性使其非常有希望成为临床治疗的新型抗肿瘤微管类化合物。第二部分Combretastatin A-4与化疗药物联合用药的抗肿瘤活性评价及机制的探讨目的：随着对CA-4抗肿瘤活性探讨的深入,人们发现CA-4还是作用于肿瘤血管的靶向药物。据报道,CA-4在无细胞毒浓度下,作用一定时间后不但能显著地抑制新生血管的生成而且还能破坏即成的血管官腔,造成肿瘤内部大面积的坏死。但是CA-4对肿瘤的增殖抑制只限于其内部,对于肿瘤边缘血管较丰富区域的细胞增殖没有显著的抑制作用,因而常导致临床上治疗的失败。所幸的是,肿瘤边缘血管丰富区域的细胞对传统的放疗化疗方式较敏感,这就提示了我们CA-4具有联合用药的潜力和优势。本实验的探讨旨在寻找不同作用机制的传统化疗药物与CA-4合用,克服两药自身临床运用的限制,以期在提升两者疗效的同时降低化疗药物的毒副作用。策略和结果：通过肿瘤细胞增殖抑制实验结果表明,肿瘤坏死因子超家族成员TRAIL与CA-4合用在人结肠癌SW620和HCT116细胞中具有协同抑制细胞增殖的作用。而DAPI染色和PI单染结合流式细胞术显示这种协同抑制细胞增殖的作用是通过诱导细胞的凋亡来实现的,且两药合用引起的细胞凋亡率比单用组的凋亡率要高6-8倍。进一步根据western blot数据表明这种细胞凋亡的生物学效应可能是通过直接激活caspase酶级联反应而引起的。人结肠癌SW620裸小鼠移植瘤实验也证实TRAIL和CA-4合用后对SW620肿瘤的生长有显著的协同抑制作用,6.25mg/kg CA-4,30mg/kg TRAIL单用组以及合用组在给药20天后的抑瘤率分别为31.2%,59.2%和78.1%。此外肿瘤组织切片的TUNEL染色实验表明给药后确实能引起肿瘤组织中的细胞发生凋亡,并且根据TUNEL染色的荧光强度显示两药合用组引起的细胞凋亡要显著地高于两药单用组。为进一步揭示TRAIL和CA-4合用协同诱导凋亡的潜在机制,我们通过免疫荧光技术以及核质分离试验初步表明转录因子NF--κB的核转位历程受抑制是两药合用产生协同效果的前提。结论：本实验通过相关抗肿瘤活性的评价,发现肿瘤坏死因子超家族成员TRAIL和CA-4联合用药可协同抑制人结肠癌细胞的增殖。并且采取分子生物学技术初步证实这种联合用药方式可能是通过抑制转录因子NF--κB的核转位,影响了NF-κB对下游相关基因的转录调控,诱导肿瘤细胞发生凋亡来实现的。基于TRAIL对肿瘤细胞的高选择性,而对正常组织细胞的毒性较小,TRAIL和CA-4两药的联合运用将为今后的临床合理用药提供新的思路和案例。第三部分Combretastatin A-4诱导的自噬及其抗肿瘤作用的机制探讨目的：CA-4具有广谱的抗肿瘤活性,并且在远低于最大耐受剂量的浓度下,CA-4能导致肿瘤血管关闭、坏死进而发挥其抗肿瘤活性。随着临床试验的深入,人们发现CA-4不能完全发挥其药效,究其理由可能是其无法抑制化疗后残存肿瘤组织的增殖,但具体机制并不明确。而本部分实验的探讨重点在于探讨CA-4的抗肿瘤活性与自噬之间的联系,并希望通过对两者相互作用的分子机制的探讨,解决CA-4在临床上运用受限制的理由,有针对性地开发以CA-4为核心的临床用药的配伍案例,以提升CA-4自身抗肿瘤活性,扩大CA-4的临床运用前景。策略和结果：在本课题的探讨中我们利用经典的检测自噬的手段,如吖啶橙染色法,GFP-LC3标示法以及LC3I/II比值法,观察到CA-4能诱导多种肿瘤细胞发生自噬。接着在给予了自噬抑制剂3-MA或者采取siRNA沉默技术降低调节细胞自噬历程中的重要因子Atg5的表达后,流式细胞术检测细胞凋亡率的结果表明CA-4诱导的.自噬属于保护性自噬,抑制自噬的发生可以增强CA-4诱导细胞凋亡的能力。进一步地通过western blot实验表明,在非InTOR依赖性的Bcl2-III型P13K复合物-becpn1信号转导通路中,Bcl-2的磷酸化水平显著上调,而在转入JNK-1siRNA抑制Bcl-2的磷酸化水平后发现CA-4引起的细胞自噬被抑制,而CA-4诱导的细胞凋亡能力显著增强。结论：我们首次发现作为血管靶向药物CA-4能诱导多种细胞产生自噬,通过采取经典的细胞与分子生物学实验技术与策略初步阐明CA-4引起细胞自噬的分子机制,即Bcl2-PI3K-becpn1信号转导通路可能在CA-4引起的自噬中发挥着重要作用。而在这历程中自噬的发生极大限制了CA-4诱导细胞产生凋亡的能力,引入自噬抑制剂能显著得增强CA-4诱导细胞发生凋亡的能力。本项目的探讨初步揭示了CA-4引起肿瘤细胞自噬的机制,及与其抗肿瘤作用之间的联系,而且可为其它可诱导肿瘤细胞自噬的抗肿瘤药物的临床运用提供重要的论述参考。关键词：微管靶点药物论文combretastatin论文A-4论文CA-4衍生物论文联合用药论文保护性自噬论文
致谢5-6
中文摘要6-12
Abstract12-16
目次16-20
绪论20-25
1 第一部分Combretastatin A-4衍生物的抗肿瘤活性及其机制的探讨25-52
1.1 引言25-27
1.2 实验材料和仪器27-31
1.2.1 细胞株27
1.2.2 药物与主要试剂27-30
1.2.3 仪器设备30-31
1.3 实验策略31-36
1.3.1 细胞培养31
1.3.2 MTT法测定XN05对肿瘤细胞的增殖抑制作用31
1.3.3 流式细胞术的检测策略31-32
1.3.4 western blot检测相关蛋白的表达32-33
1.3.5 Tubupn Polymerization Assay Biochem Kit检测法33-34
1.3.6 体内微管聚合实验34
1.3.7 免疫荧光实验34-35
1.3.8 数据浅析35-36
1.4 实验结果36-49
1.4.1 CA-4衍生物XN05体外抗肿瘤活性36-37
1.4.2 XN05对细胞内微管聚合的影响37-40
1.4.3 XN05对肝癌细胞细胞周期的影响40-43
1.4.4 XN05能诱导肝癌细胞发生凋亡43-45
1.4.5 XN05诱导G2/M期周期阻滞历程各相关周期蛋白所起的变化45-47
1.4.6 XN05诱导的细胞凋亡伴随着caspase蛋白酶级联反应的激活47-49
1.5 讨论49-52
2 第二部分 Combretastatin A-4与化疗药物联合用药的抗肿瘤活性评价及机制的探讨52-82
2.1 引言52-55
2.2 实验材料和仪器55-57
2.2.1 细胞株55
2.2.2 药物与主要试剂55-56
2.2.3 仪器设备56
2.2.4 实验动物56-57
2.3 实验策略57-63
2.3.1 细胞培养57
2.3.2 MTT法测定CA-4与TRAIL合用对肿瘤细胞的增殖抑制作用57-58
2.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡58
2.3.4 western blot检测相关蛋白的表达58-60
2.3.5 DAPI染色观察CA-4与TRAIL合用对细胞形态的影响60
2.3.6 免疫荧光实验观察NF-κB的核转位情况60-61
2.3.7 核质分离实验检测细胞内NF-κB表达情况61
2.3.8 人结肠癌SW620裸小鼠移植瘤模型的建立61-62
2.3.9 数据统计62-63
2.4 实验结果63-79
2.4.1 体外CA-4与TRAIL联合用药能协同抑制人结肠癌细胞的生长63-66
2 4.2 CA-4与TRAIL联合用药对结肠癌细胞凋亡的影响66-69
2.4.3 CA-4与TRAIL联合用药对细胞凋亡通路相关蛋白表达的影响69-71
2.4.4 CA-4与TRAIL联合用药对核转录因子NF-κB的影响71-75
2.4.5 CA-4与TRAIL合用对人结肠癌裸小鼠移植瘤生长的影响75-77
2.4.6 TUNEL染色检测CA-4与TRAIL合用对肿瘤组织中细胞凋亡的影响77-78
2.4.7 CA-4与TRAIL合用对肿瘤组织中相关凋亡蛋白表达的影响78-79
2.5 讨论79-82
3 第三部分 自噬在微管靶点药物CA-4抗肿瘤活性中的作用及其机制探讨82-103
3.1 引言82-84
3.2 实验材料和仪器84-86
3.2.1 细胞株84
3.2.2 药物与主要试剂84-85
3.2.3 主要仪器85-86
3.3 实验策略86-89
3.3.1 细胞培养86
3.3.2 吖啶橙(AO)染色86
3.3.3 细胞凋亡检测手法86-87
3.3.4 western blot法检测自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白表达的情况87-88
3.3.5 siRNA沉默技术88
3.3.6 数据浅析88-89
3.4 实验结果89-101
3.4.1 CA-4能诱导多种肿瘤细胞发生自噬89-92
3.4.2 自噬对CA-4诱导的细胞凋亡的影响92-97
3.4.3 JNK介导的Bcl-2磷酸化水平在CA-4诱导的自噬中作用97-101
3.5 讨论101-103
4. 第四部分 结论103-105
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