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摘要：细胞因子是一类能在细胞之间传递信息、具有免疫调节和反应功能的蛋白质或小分子多肽。其在动物体内有着着一套复杂的自我调控网络,当某种细胞因子分泌过量时,机体就可以通过分泌可溶受体或者拮抗剂来中和该种细胞因子的作用。白介素l受体拮抗(IL-lra)就是首个被发现的特异性的天然拮抗剂分子,其属于白介素l家族,可以特异性地与白介素l受体结合,以而中和IL-lα和IL-lβ介导的生物学反应。大量实验已经证明体内过量的IL-lα和IL-lβ能引起炎症疾病如类风湿性关节炎等。由Amgen公司生产的重组人白细胞介素l受体拮抗剂(rhIL-1ra,商品名Kineret)已经于2001年被美国FDA和欧洲EMEA批准上市用于类风湿性关节炎的治疗。2009年以后的一系列人体以及动物实验结果还发现IL-lra对2型糖尿病有着显著的治疗效果。但是Kineret的分子量只有17.3kDa,使其易被肾小球滤过,在人体的半寿期只有4到6个小时。病人为了达到一定的血药浓度和治疗效果,需要每天皮下给药。频繁的给药次数增加了病人的生理、心理和经济负担,由此临床上对长效白介素l受体拮抗剂有着迫切的需求。人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是人体血液中含量最高的蛋白,因为其广泛的体内分布、较长的半寿期以及较低的免疫源性,使得它成为改善低分子量蛋白药动学的理想载体。本论文将HSA基因与IL-lra基因融合后在毕赤酵母中表达,提升了IL-lra的药物动力学性能,为长效IL-lra的临床开发提供了论述和实验基础。IL-lra与HSA融合基因的构建及毕赤酵母转化设计合适的引物将pET41a-IL-1ra和pPIC9-HSA中的IL-1ra、HSA基因片段扩增,然后用三片段连接的原理将pPIC9载体、IL-lr段和HS段连接,转化到DH5α菌株。酶切鉴定正确后再经测序进一步验证插入序列的正确性。把含有构建正确的pPIC9-IL-1ra-G-HSA的DH5a菌株扩大培养后,用中抽试剂盒提取质粒,进一步用Sal I酶线性化后转入酵母感受态细胞中。转化后的克隆以αfactor和3'-AOX为引物,经PCR验证融合蛋白基因成功导入到毕赤酵母中。IL-1ra与HSA融合蛋白的表达、质量制约及半寿期的测定在19L的发酵罐中诱导表达了IL-lra与HSA融合蛋白,然后用超滤以及色谱纯化IL-1ra-G-HSA蛋白。建立了IL-1ra-G-HSA蛋白质量制约标准,结果显示融合蛋白同时具有HSA和IL-lra的免疫源性,活性在等摩尔条件下大约是IL-lra的10%。对ICR小鼠皮下给药IL-lra与HSA融合蛋白,在不同时间点眼眶取血,用IL-lra的ELISA策略对血药浓度进行测定。经DAS软件拟合后的药动学参数结果显示融合蛋白的半寿期较IL-lra延长了约20倍。融合蛋白在毕赤酵母中降解不足探讨当IL-lra与HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达时有显著的降解条带有着。经过Western blotting、N端氨基酸测序以及MALDI-TOF鉴定该降解条带的位点发生在HSA的C端。有文献报道类似的降解在酿酒酵母中是由精氨酸水解酶引起的,除了精氨酸水解酶,Protease A和Protease B是毕赤酵母中两种主要的水解酶,将这两个水解酶敲除后可以抑制下游多种水解酶的表达。由此本论文中比较了7种单个精氨酸水解酶缺陷宿主以及Protease A和ProteaseB缺陷宿主对IL-lra与HSA融合蛋白降解的影响。结果显示单个精氨酸水解酶缺陷宿主对减少融合蛋白的降解没有显著帮助,而在Protease A和Protease B缺陷宿主中降解产物有显著减少。多拷贝以及分子伴侣共表达增加融合蛋白的表达量为了提升IL-lra-G-HSA的表达量,我们考察了基因拷贝数以及共表达分子伴侣对其的影响。在本论文中IL-lra与HSA融合基因被连接到pPICZaB质粒并且转化到GS115中,结果显示融合蛋白在高拷贝的的宿主表达量提升了约1.6倍。在高拷贝的基础上,我们又导入了分子伴侣,使得表达量进一步提升了约2.4倍。IL-lra与HSA融合基因治疗自发性2型糖尿病模型GK大鼠近年来许多实验以及临床结果表明2型糖尿病常常伴随着免疫因子的失调,由此不少学者提出了2型糖尿病的起因就是由于免疫炎症因子诱导了胰腺中β细胞凋亡。人们在利用IL-lra治疗免疫性疾病患者时发现其有效地降低了病人血糖以及提升了p细胞的功能。GK大鼠属于自发性2型糖尿病模型,2009年有文章报道IL-lra治疗1个月后GK大鼠的血糖以及相关指标有显著改善。
致谢5-6
中文摘要6-9
Abstract9-13
缩写、符号清单、术语表13-15
目录15-17
第一章 绪论17-24
1.1 IL-1ra介绍17-18
1.2 HSA融合蛋白延长药物半寿期平台介绍18-20
1.3 毕赤酵母表达系统20-22
1.4 IL-1ra治疗2型糖尿病22-24
第二章 IL-1ra与HSA融合在毕赤酵母中表达与鉴定24-48
2.1 实验材料及基本操作25-30
2.2 实验策略30-39
2.3 实验结果39-45
2.4 讨论45-47
2.5 小结47-48
第三章 IL-1ra与HSA融合蛋白的表达、质量制约及半寿期的测定48-73
3.1 实验设备及基本操作48-51
3.2 实验策略51-57
3.3 实验结果57-69
3.4 讨论69-72
3.5 小结72-73
第四章 IL-1ra-G-HSA融合蛋白降解探讨73-101
4.1 实验设备及操作73-75
4.2 实验策略75-85
4.3 实验结果85-99
4.4 讨论99-100
4.5 总结100-101
第五章 多拷贝及分子伴侣提升IL-1ra-G-HSA表达量101-119
5.1 实验材料及基本操作102
5.2 实验策略102-109
5.3 实验结果109-116
5.4 讨论116-118
5.5 小结118-119
第六章 IL-1ra-G-HSA蛋白治疗GK大鼠119-128
6.1 实验材料及基本操作119
6.2 实验步骤与策略119-122
6.3 实验结果122-126
6.4 讨论126-127
6.5 总结127-128
结论与展望128-129