简析转染重组高密度脂蛋白粒子作为药物和影像制剂载体科技-turnitin论文查重

摘要：脂蛋白是一类具有复杂结构的生物大分子，具有一个由甘油三酯和胆固醇酯组成的疏水性脂质内核，被含有载脂蛋白和游离胆固醇的磷脂单分子层所包裹。磷脂单分子层上的载脂蛋白不仅稳定磷脂层的结构，而且维持着脂蛋白的生物活性，在体内通过不同的受体将脂蛋白转运到不同的细胞中进行代谢。脂蛋白作为内源性的大分子，具有生物可降解性和生物相容性，不会激发免疫反应，以及不会被单核细胞吞噬系统识别并清除，这些优点使得脂蛋白具有作为输送载体的潜力，以而近年来引起了广泛的关注和探讨。高密度脂蛋白(HDL)作为脂蛋白家族中的一员，主要参与了胆固醇逆向转运历程，将外周细胞中的胆固醇逆向输送到肝脏进行代谢。HDL中主要的载脂蛋白是载脂蛋白A-I，在胆固醇逆向转运历程中起着重要的作用。载脂蛋白A-I通过巨噬细胞上的ATP结合盒转运子A1(ABCA1)与胆固醇组合成HDL，然后在肝脏上通过HDL的受体，清道夫受体B类I型(SR-BI)，使肝细胞选择性摄取HDL中被酯化的胆固醇，这个历程即胆固醇逆向转运历程。HDL在肝细胞上的另一个受体是ATP合成酶的β链，介导了HDL的内吞，HDL在肝细胞内与内涵体结合，但没有经过溶酶体的降解，通过逆胞饮重新被排出肝细胞。根据HDL的特性，例如较小的粒径，被包裹的内核以及被受体调节的摄取，我们设想将高密度脂蛋白构建为一种肝脏主动靶向的载体，能够将不同的物质输送到肝脏中。我们将含有子优化的载脂蛋白A-I cDNA的质粒转入大肠杆菌表达载体BL21(DE3)pLysS中，通过生物工程的策略分离纯化得到大量的重组载脂蛋白A-I。我们验证了重组载脂蛋白A-I具有与野生型载脂蛋白A-I同样的生物活性，能够与磷脂快速重组成HDL。为了利用HDL参与胆固醇逆向转运的特性，我们在胆固醇的3’位置上连接乙二胺，并且利用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)双酸酐的胺解反应将乙二胺-胆固醇连接到DTPA上，利用硅胶分离纯化出两种化合物： DTPA单酰胺(DTPA-chol)和DTPA双酰胺产物(DTPA-(chol)2)。将两种产物分别与钆离子进行螯合，得到连接胆固醇基团的Gd-DTPA衍生物Gd-DTPA-chol和Gd-DTPA-(chol)2，利用核磁、高分辨质谱等策略对化合物进行了确认。我们计算出两种钆螯合物的纯度大于99.5%。我们利用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、重组载脂蛋白A-I、钆螯合物通过胆酸钠表面活性剂法组装成重组Gd-HDL。利用NaBr密度梯度超速离心法进行分离纯化。然后分别通过动态光散射法、透射电镜、MRI等策略对重组Gd-HDL进行探讨，测定了重组Gd-HDL中的蛋白和钆螯合物的浓度，计算出NaBr密度梯度离心的样品回收率；对重组Gd-HDL的粒径、形态以及对水质子的纵向弛豫效率进行了表征，发现重组Gd-HDL的粒径在20-25nm之间，形态为圆盘状，并且其纵向弛豫效率r1要高于商业化的造影剂Gd-DTPA，Gd-chol-HDL的纵向弛豫效率比Gd-DTPA的提升78%，Gd-(chol)_2-HDL的纵向弛豫效率则比Gd-DTPA的提升了20%。在体外细胞实验中，利用人肝癌细胞HepG2细胞，我们发现重组Gd-HDL具有与野生型HDL相同的生物活性，能够将钆螯合物输送到HepG2细胞中，并且证明是通过细胞上的HDL受体将钆螯合物摄取到细胞中。然后利用CCK-8法测定了两种重组Gd-HDL与商业化造影剂Gd-DTPA对HepG2细胞的毒性作用。为了探讨重组Gd-HDL作为造影剂在体内的成像效果，在大鼠的MRI实验中，通过尾静脉注射剂量为10μmol Gd/kg的重组Gd-HDL后，利用3T MRI仪器在不同的时间点进行扫描，获得T1加权的MRI图像。测量各个时间点的肝脏MRI信号，与注射前的信号进行比较，计算其相对强化率。发现两种重组Gd-HDL能够在低浓度下有效增强肝脏部位的MRI信号，并且持续到24小时仍然有较高的信号，表明重组Gd-HDL可以实现肝脏的磁共振靶向造影。并且大鼠的十二指肠部位的MRI信号也同样得到了增强，表明钆螯合物可能通过胆固醇代谢途径进行代谢，而且Gd-DTPA-chol和Gd-DTPA-(chol)2可能分别代表了胆固醇不同的代谢途径。我们对重组HDL作为质粒DNA靶向输送的载体进行了探讨。在体外细胞实验中，重组HDL在组装有阳离子胆固醇衍生物CDAN后，能够实现DNA靶向输送和提升转染效果的实验目标。在体内实验中，我们探讨了重组HDL在小鼠体内的分布，表明重组HDL主要聚集在肝脏部位，而且持续的时间较长。我们也对重组HDL作为siRNA的输送载体进行了探讨。利用5种阳离子高聚物与siRNA进行复合，然后利用中性脂质EPC、载脂蛋白A-I将siRNA复合物包裹起来，得到带负电的重组HDL。实验表明重组HDL与野生型HDL的结构和功能相似。体外细胞实验表明重组HDL能够显著降低细胞中荧光素酶约70%的表达，而且证明重组HDL通过细胞上HDL受体被细胞识别和摄取。然后在小鼠体内实验中重组HDL取得了一定的效果。关键词：高密度脂蛋白论文胆固醇论文肝脏靶向输送论文磁共振成像论文造影剂论文基因转染论文RNA干扰论文

摘要3-7

ABSTRACT7-19

第一章综述19-46

1 高密度脂蛋白19-30

1.1 脂蛋白19-22

1.1.1 脂蛋白的分类19-20

1.1.2 脂蛋白的结构20-21

1.1.3 脂蛋白的代谢21-22

1.2 高密度脂蛋白的结构与功能22-27

1.2.1 新生的盘状 HDL 的形成25-26

1.2.2 球形 HDL 的形成26

1.2.3 HDL 中胆固醇的摄取26-27

1.3 HDL 作为输送载体的运用27-30

1.3.1 抗癌药物的载体27-28

1.3.2 抗病物的载体28

1.3.3 抗真菌药物的载体28

1.3.4 医学影像造影剂的载体28-29

1.3.5 基因输送的载体29-30

2 磁共振成像(MRI)30-44

2.1 MRI 的原理30

2.2 MRI 造影剂30-31

2.3 造影剂的分类31-32

2.3.1 顺磁性造影剂32

2.3.2 超顺磁性造影剂32

2.4 MRI 造影剂的体内分布和运用32-44

2.4.1 细胞外液造影剂33-34

2.4.2 血池造影剂34-36

2.4.2.1 白蛋白结合的钆螯合物34

2.4.2.2 连接钆螯合物的高聚物34-36

2.4.2.3 超小超顺磁氧化铁36

2.4.3 靶向造影剂36-44

2.4.3.1 肝胆靶向的造影剂36-37

2.4.3.2 单核吞噬细胞系统的靶向造影剂37-38

2.4.3.3 靶向淋巴结的造影剂38

2.4.3.4 靶向脑部的造影剂38-39

2.4.3.5 主动靶向或细胞标记的造影剂39-41

2.4.3.6 生物激活造影剂41-44

2.4.3.6.1 pH 敏感的造影剂41

2.4.3.6.2 酶敏感的造影剂41-43

2.4.3.6.3 金属离子敏感的造影剂43-44

3 探讨目的与内容44-46

第二章重组载脂蛋白 A-I 的表达和 GD-DTPA 衍生物的合成46-79

1 前言46-49

1.1 重组载脂蛋白 A-I 的表达46-47

1.2 DTPA 配体的连接反应47-49

1.3 胆固醇的连接反应49

2 材料与策略49-63

2.1 材料与仪器49-53

2.1.1 实验试剂49-50

2.1.2 实验溶液50-51

2.1.3 实验仪器51-53

2.2 实验策略53-63

2.2.1 载脂蛋白 A-I 的表达纯化和鉴定53-58

2.2.1.1 pNFXex 质粒的转化和保存53-54

2.2.1.1.1 感受态细胞的制备53

2.2.1.1.2 pNFXex 质粒的转化、鉴定与保存53-54

2.2.1.2 载脂蛋白 A-I 的表达54

2.2.1.3 载脂蛋白 A-I 的纯化54-55

2.2.1.4 载脂蛋白 A-I 的鉴定55-57

2.2.1.5 载脂蛋白 A-I 的活性检测57

2.2.1.6 载脂蛋白 A-I 的圆二色谱浅析57-58

2.2.2 Gd-DTPA 衍生物 Gd-DTPA-chol 和 Gd-DTPA-(chol)_2的合成58-63

2.2.2.1 胆固醇-乙二胺的合成58-59

2.2.2.2 连接胆固醇的 DTPA 配体 DTPA- chol 和 DTPA-(chol)2的合成59-60

2.2.2.3 Gd-DTPA-chol 的合成60-61

2.2.2.4 Gd-DTPA-(chol)2的合成61-62

2.2.2.5 Gd-DTPA-chol 和 Gd-DTPA-(chol)2分离纯化62

2.2.2.6 鉴定产物的钆含量62-63

2.2.2.7 产物的表征63

3 实验结果63-75

3.1 载脂蛋白 A-I 的表达纯化和鉴定63-67

3.1.1 pNFXex 质粒的转化63-64

3.1.2 载脂蛋白 A-I 的表达纯化分离64-65

3.1.3 载脂蛋白 A-I 的活性65-66

3.1.4 载脂蛋白 A-I 的α螺旋含量66-67

3.2 Gd-DTPA-chol 和 Gd-DTPA-(chol)2合成67-75

3.2.1 Gd-DTPA 和 Gd-(DTPA)2配体的合成67-72

3.2.2 Gd-DTPA-chol 和 Gd-DTPA-(chol)2螯合物的合成72-74

3.2.3 Gd-DTPA-chol 和 Gd-DTPA-(chol)2螯合物的钆含量测定74-75

4 浅析与讨论75-79

第三章重组 HDL 的制备和表征79-99

1 前言79-81

1.1 肝脏磁共振成像的造影剂79-80

1.2 重组 HDL 的制作策略80-81

2 材料与策略81-87

2.1 材料与仪器81-83

2.1.1 实验试剂81

2.1.2 实验溶液81-82

2.1.3 实验仪器82-83

2.2 实验策略83-87

2.2.1 钆-重组高密度脂蛋白(Gd-HDL)的制作83-87

2.2.1.1 利用 Gd-DTPA-chol 制作 Gd-chol-HDL83

2.2.1.2 利用 Gd-DTPA-(chol)2制作 Gd-(chol)2-HDL83-84

2.2.1.3 重组 HDL 的分离纯化84

2.2.1.4 Gd-HDL 的蛋白浓度测定84-85

2.2.1.5 Gd-HDL 的钆浓度测定85

2.2.1.6 Gd-HDL 的粒径测定85-86

2.2.1.7 Gd-HDL 的透射电镜观察(TEM)86

2.2.1.8 Gd-HDL 纵向弛豫效率 r1的测定86-87

3 实验结果87-95

3.1 Gd-chol-HDL 和 Gd -(chol)2-HDL 的制备87-88

3.2 重组 Gd-HDL 的组分测定88-89

3.3 Gd-chol-HDL 和 Gd-(chol)2-HDL 的表征89-95

3.3.1 两种重组 HDL 的粒径分布89-91

3.3.2 Gd-HDL 的透射电镜观察91-94

3.3.3 Gd-HDL 的纵向弛豫效率 r1测定94-95

4 讨论与浅析95-99

第四章重组 GD-HDL 的体外细胞实验99-116

1 前言99-103

1.1 体外细胞模型99

1.2 造影剂的毒性实验99-102

1.3 细胞毒性实验102-103

2 材料与策略103-107

2.1 材料与仪器103-105

2.1.1 实验材料103-104

2.1.2 实验溶液104

2.1.3 实验仪器104-105

2.2 实验策略105-107

2.2.1 重组 Gd-HDL 的细胞体外实验105-107

2.2.1.1 细胞培养105

2.2.1.2 细胞毒性实验105-106

2.2.1.3 细胞的摄取实验106-107

2.2.1.4 细胞的摄取抑制试验107

3 实验结果107-111

3.1 重组 HDL 对肝癌细胞 HepG2 的毒性探讨107-109

3.2 HepG2 细胞对重组 HDL 摄取的探讨109-110

3.3 竞争抑制 HepG2 细胞摄取重组 HDL 的探讨110-111

4 浅析与讨论111-116

第五章重组 HDL 的体内 MRI 探讨116-126

1 前言116-117

1.1 以脂蛋白为基础的造影剂在 MRI 中的运用116-117

2 材料与策略117-119

2.1 材料与仪器117-118

2.1.1 实验试剂117-118

2.1.2 溶液配制118

2.1.3 实验仪器118

2.2 实验策略118-119

3 实验结果119-123

3.1 大鼠的 MRI 实验119-120

3.2 大鼠肝脏信号增强浅析120-123

4 浅析与讨论123-126

第六章重组 HDL 介导基因靶向转染的探讨126-142

1 前言126-129

1.1 基因治疗126-129

2 材料与策略129-135

2.1 材料与仪器129-130

2.1.1 实验材料129-130

2.1.2 实验仪器130

2.2 实验策略130-135

2.2.1 阳离子脂质 CDAN 的合成130-131

2.2.2 重组 HDL 的合成131-132

2.2.3 重组 HDL 与 DNA 的复合实验132

2.2.4 细胞转染实验132-133

2.2.5 重组 HDL 的体内分布探讨133-135

3 实验结果135-140

3.1 阳离子的胆固醇衍生物 CDAN 的合成135

3.2 重组 HDL 与 DNA 复合后的粒径变化135-136

3.3 重组 HDL 的体外细胞转染实验136-137

3.4 重组 HDL 的体内分布探讨137-140

4 浅析与讨论140-142

第七章包裹 SIRNA 的重组 HDL 的基因沉默探讨142-175

1 前言142-148

1.1 RNA 干扰142-144

1.2 siRNA 输送载体144-148

1.2.1 化学修饰的 siRNA145

1.2.2 融合蛋白修饰的 siRNA145-146

1.2.3 脂质体146

1.2.4 高聚物146-148

1.3 重组 HDL 用于 siRNA 输送的探讨148

2 材料与策略148-158

2.1 材料与仪器148-151

2.1.1 实验材料和仪器148-150

2.1.2 实验溶液150-151

2.1.3 RNA 酶灭活处理151

2.2 实验策略151-158

2.2.1 聚阳离子高聚物复合 siRNA151-152

2.2.2 重组 HDL 的制作152-153

2.2.3 重组 HDL 的电泳检测153

2.2.4 重组 HDL 的粒径和电位153-154

2.2.5 重组 HDL 的透射电镜观察(TEM)154

2.2.6 重组 HDL 的血清稳定性实验154

2.2.7 细胞体外实验154-157

2.2.7.1 细胞培养154-155

2.2.7.2 细胞毒性实验155

2.2.7.3 细胞转染实验155-157

2.2.7.3.1 靶向荧光素酶蛋白的 siRNA 转染实验155-156

2.2.7.3.2 非荧光素酶基因靶向的 siRNA 转染实验156-157

2.2.7.4 细胞荧光共聚焦实验157

2.2.8 动物的基因沉默实验157-158

3 实验结果158-171

3.1 重组 HDL 的制作158-159

3.2 重组 HDL 的粒径和电位表征159-162

3.3 重组 HDL 的透射电镜观察162-163

3.4 重组 HDL 的血清稳定性实验163-164

3.5 体外细胞实验164-170

3.5.1 细胞毒性实验164-166

3.5.2 细胞的基因沉默实验166-168

3.5.3 细胞的竞争抑制基因沉默实验168-169

3.5.4 细胞荧光共聚焦实验169-170

3.6 小鼠的基因沉默探讨170-171

4 浅析与讨论171-175

第八章总结与展望175-179

1 全文总结175-176

2 革新点176-177

3 探讨展望177-179

简析转染重组高密度脂蛋白粒子作为药物和影像制剂载体科技

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