摘要：肺癌的发生及死亡率居各类恶性肿瘤的首位。由于肺癌不易早期发现及治疗的高难度,由此,预防肺癌的发生,对降低肺癌发生率及死亡率具有举足轻重的作用。中医的“治未病”预防疾病思想与现代医学中的化学预防异曲同工,其目的均是用药物减少肺癌的发生率。夏枯草Prunella vulgarisL.为唇形科植物,性苦寒,具清热解毒之功效,其成分主要包括三萜类、酚酸类、黄酮类、多糖等成分,具有确切的防治肺癌疗效,在临床上广泛利用。Nrf2/ARE信号通路是干预癌症发生的重要信号通路,它对细胞抵御外源有害物质以及氧化应激有着重要作用。本课题探讨以中医药治未病思想为指导,以夏枯草为模型药物,引进、消化再革新,通过Nrf2信号通路,以整体动物水平、细胞水平、分子蛋白水平,探讨夏枯草防治肺癌的物质基础及其作用机制。主要内容：1.三萜类组分的富集分离提取不同批次的夏枯草三萜,然后利用大孔树脂得到三萜类成分,建立人肺腺癌细胞A549、SPC-A-1体外药效筛选系统,对夏枯草进行了活性筛选评价,结果显示江苏产夏枯草得到的三萜对肺癌细胞的抑制作用最好,对A549、SPC-A-1的IC50分别为278.17.356.73μg/mL。2.夏枯草三萜化学预防肺癌的模型建立①人肺癌细胞模型的建立：建立肺癌细胞A549及SPC-A-1细胞模型,采取MTT法,以细胞增殖抑制率为指标,评价夏枯草三萜抗肺癌的效果,结果显示夏枯草三萜类对A549及SPC-A-1的IC50分别为278.17,356.73μg/mL。说明夏枯草对肺癌细胞具有较强抑制作用,其中A549细胞对夏枯草更为敏感。结果表明所建立的细胞模型能有效地运用于活性筛选。②人正常支气管上皮细胞模型的建立：建立人正常支气管上皮细胞Normal Human bronchial epithepal cells(NHBE)的体外药效筛选系统,采取MTT法,以细胞增殖抑制率为指标,评价夏枯草三萜抗肺癌的效果,结果显示夏枯草三萜类对NHBE的IC50为509.82μg/mL,说明夏枯草对正常细胞的抑制作用较肺癌细胞小。建立的生物化学预筛系统能有效筛出潜在的防治药物。③烟雾提取物诱导的NHBE细胞模型建立：建立烟雾提取物诱导的NHBE细胞模型,实验结果表明,NHBE细胞在10%烟雾提取物处理24h后,其抑制率为30.12±2.7%,而同时加入50、100、200、400μg/mL的夏枯草后,抑制率为26.67±1.4%、22.47±2.2%、19.39±2.3%、21.19±2.5%；CSE对NHBE有毒害作用,随浓度增加而增大。结果表明所建立的模型能反映夏枯草减少诱导物的损伤。④整体动物模型的建立：建立了KM小鼠模型,实验结果表明,夏枯草可以显著提升KM小鼠体内Ⅱ相解毒酶GST、NQO1活力与GSH含量,用5g生药/kg/d与10g生药/kg/d浓度连续灌胃一周,夏枯草低剂量组的KM小鼠体内NQO1、GST酶活力及GSH含量分别为空白对照组的1.20±0.23倍、1.75±0.37倍、5.67±0.45倍,夏枯草高剂量组的KM小鼠体内NQO1、GST酶活力及GSH含量分别为空白对照组的1.38±0.37倍、2.42±0.26倍、11.13±0.33倍；建立裸鼠模型,实验结果表明,夏枯草可以显著降低裸鼠的瘤大小,抑瘤率：夏枯草高剂量组89%,夏枯草低剂量组68%；建立A/J小鼠模型,结果表明,夏枯草可以显著降低A/J小鼠肺部肿瘤数,提升A/J小鼠的脾脏指数,与对照组比均有显著性差别(p0.05)。结果表明所建立的整体动物模型能客观地反映夏枯草预防肺癌的活性。3.夏枯草三萜类化学预防肺癌的机制探讨①夏枯草对NHBE细胞中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表达的影响：在50、100、200、400μg/mL的夏枯草生药浓度下,NHBE细胞内GST酶活力分别为100.21±5.11%、125.38±4.42%、136.48±3.96%、156.19±4.88%,NQO1酶活力分别为100.72±6.13%、113.25±4.92%、139.53±5.35%、146.81±4.27%,GSH含量分别103.37±4.86%、110.52±5.13%、125.94±5.87%、133.68±5.26%,与CSE组比均有显著性差别(p0.05)。westernblot显示夏枯草可以显著提升A549细胞中NQO1、GST及Nrf2蛋白表达。结果表明夏枯草可以提升肺正常细胞NHBE中的Ⅱ相解毒酶活力及表达,提升对外界刺激的抵御。②siRNA探讨Nrf2信号通路在夏枯草三萜保护细胞中作用：成功建立Nrf2沉默的NHBE细胞,在正常条件下,GSTPI与NQO1蛋白表达均有显著降低,加入CSE未能引起GSTPI与NQO1的过表达,同时加入夏枯草三萜也未能有显著的细胞保护作用,表明夏枯草三萜是通过Nrf2信号通路起保护细胞作用。③夏枯草对烟雾提取物细胞模型中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表达的影响：NHBE细胞在10%CSE处理24h后,GSH含量降低为对照组的35.65±6.33%,GST活力升高为对照组的1.75±0.042倍,NQO1活力升高为对照组的2.14±0.037倍,加入125μg/mL的夏枯草后,GSH含量提升到对照组72.61±5.29%,GST活力降低到对照组1.44±0.059倍,NQO1活力降低到对照组1.5±0.049倍,与CSE组比均有显著性差别(p0.05)。④熊果酸对烟雾提取物细胞模型中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表达的影响：在10%CSE与25μmol/L浓度熊果酸共同作用下,细胞内GSH含量为空白对照组的68.53±5.33%,GST活力为空白对照组的1.32±0.036倍,NQO1活力为空白对照组的1.55±0.058倍,与CSE组比均有显著性差别(p0.05),且可以减少CSE引起的细胞DNA损伤,westernblot显示熊果酸可以显著提升A549细胞中NQO1、GST及Nrf2蛋白表达。结果表明熊果酸是夏枯草三萜中有效成分之一。4.夏枯草三萜类对肺癌细胞中Ⅱ相解毒酶活力及Nrf2蛋白表达的影响：在50、100、200、400μg/mL的夏枯草生药浓度下,A549中NQO1酶活力分别为73.21±6.33%、79.34±7.86%、72.38±5.55%、61.92±4.28%,GSH含量分别为57.44±4.86%、27.23±5.92%、21.76±5.03%、18.40±4.22%,SPC-A-1细胞中NQO1酶活力分别为91.09±5.34%、96.42±3.79%、74.57±4.39%、65.78±5.18%,GSH含量分别为52.53±3.18%、25.24±4.82%、20.19±4.76%、17.32±3.92%,与对照组比均有显著性差别(p0.05),westernblot显示夏枯草可以显著降低A549细胞中NQO1、GST及Nrf2蛋白表达。夏枯草可以降低肺癌细胞A549中的Ⅱ相解毒酶活力及表达,降低对外界刺激的抵御。结论：不同产地、不同品种夏枯草属药材其内在的药效物质基础有着本质区别。夏枯草三萜对正常细胞的抑制率较肺癌细胞低。10%CSE作用24h情况下,NHBE细胞抑制率约为30%,而加入125μg/mL夏枯草三萜会使抑制率降低至80%,说明夏枯草具有细胞保护作用。夏枯草三萜可以显著减少苯并芘诱导的A/J小鼠中肺部肿瘤数,在裸鼠模型中,夏枯草三萜可抑制肿瘤进展,夏枯草三萜在KM小鼠内可以刺激Ⅱ相解毒酶的活力。在肺癌细胞A549与SPC-A-1中,夏枯草可降低Nrf2表达,GSTPI和NQO1表达及活力,GSH含量,且呈现出量效联系,而在NHBE细胞中则反之。熊果酸可以保护CSE作用的NHBE细胞,恢复由CSE引起的细胞内指标的转变,减少细胞DNA损伤,可能是夏枯草具有细胞保护作用的理由之一。关键词：夏枯草三萜论文化学预防论文治未病论文肺癌论文Nrf2论文
摘要3-6
Abstract6-11
缩略词表11-12
目录12-14
第一章 绪论14-21
1.1 化学预防是中医“治未病”的对策之一14-17
1.2 PKC、PI3K、MAPK信号通路对Nrf2/ARE的调控及中药的干预作用17-18
1.3 中药活性成分通过Nrf2途径诱导的Ⅱ相解毒酶18-19
1.4 中药活性成分通过Nrf2途径诱导氧化还原酶19-20
1.5 中药活性成分通过Nrf2途径调控转运蛋白的表达20
1.6 小结与展望20-21
第二章 夏枯草三萜预防肺癌的物质基础探讨21-28
2.1 不同批次夏枯草三萜类得率及药效浅析比较21-23
2.1.1 仪器与试药21
2.1.2 夏枯草三萜的制备21-22
2.1.3 夏枯草三萜对A549细胞增殖的影响22
2.1.4 结果与讨论22-23
2.1.5 本节小结23
2.2 夏枯草属药材三萜类化学成分比较23-27
2.2.1 仪器与试药23
2.2.2 色谱条件23
2.2.3 样品制备23
2.2.4 策略学考察23-24
2.2.5 结果与浅析24-27
2.3 本章小结27-28
第三章 夏枯草三萜肺癌化学预防作用的体外探讨28-37
3.1 肺癌细胞筛选模型的建立28-30
3.1.1 仪器与材料28-29
3.1.2 MTT法检测夏枯草三萜对A549与SPC-A-1细胞增殖的抑制29
3.1.3 结果与讨论29-30
3.1.4 本节小结30
3.2 NHBE肺正常细胞筛选模型的建立30-32
3.2.1 仪器与材料30-31
3.2.2 MTT法检测夏枯草三萜对NHBE细胞的抑制率31
3.2.3 结果与讨论31-32
3.2.4 本节小结32
3.3 夏枯草三萜保护提取物作用的NHBE细胞32-36
3.3.1 仪器与材料32-33
3.3.2 实验策略33-34
3.3.3 结果与讨论34-36
3.3.4 本节小结36
3.4 本章小结36-37
第四章 夏枯草三萜肺癌化学预防的体内探讨37-46
4.1 人肺癌细胞移植裸鼠模型的建立37-40
4.1.1 材料37-38
4.1.2 策略38
4.1.3 结果与讨论38-40
4.1.4 本节小结40
4.2 A/J小鼠诱导模型的建立40-42
4.2.1 仪器与试药40
4.2.2 策略40-41
4.2.3 结果与讨论41-42
4.2.4 本节小结42
4.3 KM小鼠诱导模型的建立42-45
4.3.1 仪器与材料42-43
4.3.2 策略43-44
4.3.3 结果与讨论44
4.3.4 本节小结44-45
4.4 本章小结45-46
第五章 夏枯草三萜及熊果酸肺癌化学预防的机制探讨46-60
5.1 夏枯草三萜对NHBE中GSH含量、酶活力及蛋白表达的影响46-50
5.1.1 仪器与材料46-47
5.1.2 实验策略47-48
5.1.3 结果与讨论48-49
5.1.4 本节小结49-50
5.2 siRNA确认信号通路50-52
5.2.1 仪器与材料50
5.2.2 实验策略50-51
5.2.3 结果与讨论51
5.2.4 本节小结51-52
5.3 熊果酸及夏枯草三萜降低CSE诱导模型中Ⅱ相解毒酶的活力及蛋白表达52-59
5.3.1 仪器与材料52
5.3.2 实验策略52
5.3.3 结果与讨论52-58
5.3.4 本节小结58-59
5.4 本章小结59-60
第六章 夏枯草三萜对肺癌细胞中Nrf2信号通路的影响60-64
6.1 仪器与材料60
6.2 实验策略60
6.3 结果与讨论60-63
6.4 本章小结63-64
第七章 讨论64-66
第八章 结论与革新点66-68
7.1 结论66
7.2 革新点66-68
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