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摘要：食管癌是一种常见的恶性肿瘤,在全球的恶性肿瘤中,其发病率和死亡率分别排在第8位和第6位。我国是食管癌的高发区。上皮来源的食管癌分两个亚型：食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)。我国的食管癌以鳞癌为主。一直以来手术切除都是最主要的治疗手段,但术后肿瘤的转移仍影响着患者的预后。由此,改善食管鳞癌患者的发病和死亡率的关键是制约肿瘤的转移。然而目前转移的分子机制仍不完全清楚。已有探讨表明,仅有19-24个核苷酸的小、RNA (miRNAs)作为一类高度保守的非编码RNA,在多种恶性肿瘤的发生历程中起到重要作用。我们前期芯片结果证明实miR-25在食管癌中显著高表达。然而,其在食管鳞癌中所发挥的生物作用机制仍不明了。本探讨的目的是揭示miR-25在食管癌中的表达方式及其在食管癌发生中发挥的作用。在本探讨当中,我们发现miR-25在60例食管鳞癌组织及5株食管鳞癌细胞系细胞中显著高表达,并且在食管癌组织中miR-25的DNA拷贝数显著增加。同时发现,miR-25的高表达与淋巴结的转移及肿瘤的TNM分期密切相关。我们同时检测了28例正常食管粘膜组织和24例食管粘膜不典型增生组织中miR-25的水平,发现miR-25的表达水平在正常食管粘膜、不典型增生及食管鳞癌组织中是依次增高的,而且之间的差别有统计学作用。在体外实验中发现,通过转染miR-25前体分子使细胞中的miR-25过度表达,能够推动细胞的侵袭和转移；反之,抑制细胞中miR-25的表达,能够抑制细胞侵袭和转移的能力。然而调整miR-25的表达量,对食管鳞癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期无显著影响。我们通过双荧光素酶报告基因实验证明CDH1是miR-25的靶基因。众所周知,CDH1是一种抑制肿瘤转移的重要分子,并且其在食管鳞癌的发生历程中频繁的低表达。在体外实验中发现,miR-25表达增高,CDH1蛋白表达降低；反之,miR-25表达降低,CDH1蛋白表达增高。而且miR-25的表达量与CDH1蛋白表达量呈显著负相关。当在细胞内过表达CDH1,能够削弱细胞由于miR-25的过表达而增强的侵袭和迁移能力。综上所述,我们发现miR-25在食管鳞癌组织中表达增高。miR-25的高表达水平与食管鳞癌的发生有关。进一步实验证明,miR-25通过抑制CDH1蛋白的表达推动细胞的侵袭和转移。关键词：食管鳞癌论文细胞转移论文细胞侵袭论文miR-25论文CDH1论文
表索引5-6
图索引6-7
中英文缩略词7-9
摘要9-11
Abstract11-13
前言13-23
一、食管癌的探讨进展13-15
二、miRNA的探讨进展15-21
三、CDH1在肿瘤中的探讨进展21-23
实验材料23-28
一、实验样本23
二、主要试剂23-24
三、溶液配制24-25
四、主要仪器设备25-26
五、细胞系及培养条件26-27
六、菌株与质粒27-28
实验策略28-52
一、配对食管癌组织样本采集28
二、细胞系28-29
三、mRNA及miRNAs的提取29-31
四、半定量RT-PCR检测mRNA表达水平31-33
五、实时定量PCR(Real-time PCR)33-35
六、蛋白印记Western Blotting35-38
七、细胞转染38-39
八、细胞功能实验39-41
九、质粒构建41-47
十、双荧光素酶报告基因实验47-49
十一、CDH1回复实验49
十二、miR-25基因拷贝数检测49-51
十三、统计浅析策略51-52
实验结果52-66
一、miR-25在ESCC组织和ESCC细胞系中的表达水平52-56
二、miR-25在食管癌中的功能探讨56-60
三、miR-25下游靶基因生物信息学预测60
四、miR-25下游靶基因生物学实验验证60-66
讨论66-71
结论71-72