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摘要：肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）是一种多功能的蛋白。c-Met为HGF的受体，是一种原癌基因的蛋白产物。它是一种具有生长因子受体结构和功能性质的跨膜酪氨酸激酶。一旦结合至其配体，该受体发生自我磷酸化可刺激其内在的酪氨酸激酶活性，以而引起细胞的迁移、增殖和侵袭等行为的转变。已在多种人类的肿瘤中发现c-Met基因的过表达。HGF/c-Met通路已被证实影响着许多恶性肿瘤的发生和进展。在骨髓瘤病人的血清和骨髓中发现HGF浓度显著高于正常人，并且发现这跟病人的预后呈显著的负相关。之前有探讨显示，c-Met及其配体HGF在多株骨髓瘤细胞系和原代骨髓瘤细胞中高表达。此外，有探讨指出HGF可推动骨髓瘤细胞的增殖和迁移。综上，我们推测阻断HGF/c-Met信号通路也许对多发性骨髓瘤的治疗具有重要的作用。NK4是一种HGF的拮抗剂，由N末端的发夹结构和4个kringle结构域组成。NK4一旦结合至c-MET上，可竞争性拮抗HGF所诱导的c-MET酪氨酸磷酸化作用，以而抑制HGF所介导的细胞增殖、迁移和侵袭。此外，NK4还具有抑制成纤维细胞生长因子（BFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）所诱导的血管生成作用。NK4除了HGF拮抗活性外的抗血管生成活性可能与其结构类似血管抑制生长因子的4个kringle结构域有关。NK4这种具有抑制肿瘤细胞和肿瘤血管生成的多重功能，暗示了其在多发性骨髓瘤患者治疗的潜在价值。在本课题，我们初步探讨了Ad-NK4对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226生物学行为的影响及可能的机制，旨在为NK4在多发性骨髓瘤治疗中的潜在临床运用提供论述基础和实验依据。第一部分利用Gateway技术构建重组腺病毒pAd-NK4探讨目的:利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子（HGF）NK4基因的重组腺病毒载体。探讨策略:以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因，将回收的NK4PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。以该重组质粒上，利用LR同源重组将NK4-IRES-EGPF表达框转移至腺病毒骨架质粒pAD/BL-DEST，获得重组腺病毒质粒pAd-NK4-IRES-EGFP。该质粒经pacI线性化后转染293包装细胞获得重组腺病毒rAd-NK4-IRES-EGFP。采取TCID50（Tissue cell infectious dosage50，TCID50）法测定重组腺病毒滴度。重组腺病毒分别经酶切和PCR等策略进行鉴定。荧光显微镜观察转染效果。探讨结果:证实腺病毒载体中含有NK4基因的目的片段；病毒滴度为6.3×108PFU/ml；荧光显微镜发现该重组腺病毒能在HEK293细胞中高效的表达。结论:利用Gateway技术可以快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色荧光的重组腺病毒，为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。第二部分Ad-NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖的影响探讨目的:观察Ad-NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖的影响及可能机制。探讨策略:1. Western blot和RT-PCR检测在转染Ad-NK4的RPMI8226细胞中NK4的表达。2.MTT法体外观察Ad-NK4对RPMI8226细胞增殖抑制作用。3. PI单染流式细胞仪检测Ad-NK4对RPMI8226细胞凋亡发生率的影响。4. DNA琼脂糖凝胶电泳实验验证Ad-NK4对RPMI8226细胞的诱导凋亡作用。5. Western blot检测Akt/mTOR通路主要执行蛋白、细胞周期调控蛋白及细胞凋亡相关蛋白的表达。探讨结果:1.Ad-NK4转染的RPMI8226细胞组中NK4基因的表达显著高于对照组。2. Ad-NK4转染的RPMI8226细胞组在24、48和72小时的增殖抑制率分别为33.5%±1.21%、52.8%±1.63%和54.8%±1.77%（p0.05）。3. PI单染流式细胞仪检测结果显示Ad-NK4转染的RPMI8226细胞组的凋亡率为21.2%，显著高于对照组（3.52%）。4. DNA琼脂糖凝胶电泳实验显示Ad-NK4转染的RPMI8226细胞组的DNA有特点性“梯级”断裂。5.细胞周期调控蛋白CDK4和Cycpn D1被下调，而P27蛋白却被上调。抗凋亡蛋白Bcl-2被下调，而促凋亡蛋白Bax、Cleed caspase-9和Cleed caspase3的表达均增加。相应地，Bax/Bcl-2二者的比例在增加。Akt/mTOR信号通路下游主要执行蛋白如P-T, P-mTOR, P-70S6K和P-4BEP-1等的表达量均被下调，但T-T的表达量未受到影响。结论：Ad-NK4可抑制人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的增殖，并且通过上调Bax/Bcl-2二者的比例和活化caspase而导致的细胞凋亡是其增殖抑制的重要因素。此外，Akt/mTOR信号通路可能参与了其凋亡历程。第三部分Ad-NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞粘附的影响探讨目的:观察Ad-NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞粘附的影响及可能机制。探讨策略:1.细胞-基质粘附实验检测Ad-NK4对RPMI8226细胞粘附影响。2. RPMI8226细胞和ECV304细胞粘附实验检测Ad-NK4对RPMI8226细胞粘附的影响。3. Western blot检测粘附和侵袭相关蛋白MMP2\MMP3\MMP7\VEGF表达的变化。探讨结果:1. RPMI8226细胞与基质Matrigel粘附实验显示：Ad-NK4组、UO126作用组、RAPA作用组及AG490作用组对粘附的抑制率分别为62.6%、47.8%、15.7%和50.5%，均显著高于Ad-GFP组（0.4%）（P0.05）。另外，RPMI8226细胞与基质FN粘附实验显示：Ad-GFP组、Ad-NK4组、UO126作用组、RAPA作用组及AG490作用组对粘附的抑制率分别为0、46.2%、59.4%、7.7%和55.8%，其中Ad-NK4组、UO126作用组和AG490作用组对粘附的抑制率均显著高于未转染组（P0.05）。而RAPA作用组、Ad-GFP组和未转染组之间对粘附的抑制率无显著差别（P0.05）。2.RPMI8226细胞与ECV304粘附实验显示：Ad-NK4组、UO126作用组、RAPA作用组及AG490作用组对粘附的抑制率分别为61.9%、58.8%、20.7%和54.1%，均显著高于未转染组（P0.05）。而Ad-GFP组和未转染组之间对粘附抑制率无显著差别（P0.05）。3.与未转染组或Ad-GFP组相比较，Ad-NK4组能显著降低RPMI8226细胞MMP-2、MMP-3和VEGF蛋白的表达水平（P0.05），但对MMP-7的蛋白表达水平无显著影响（P0.05）。另外，Ad-GFP组和未转染组之间对MMP-2、MMP-3、MMP-7和VEGF蛋白的表达水平无显著差别（P0.05）。结论： Ad-NK4可抑制人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的粘附作用，Erk信号通路和J/STAT信号通路可能涉及。第四部分Ad-NK4与硼替佐米联合对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡的作用探讨目的:探讨Ad-NK4与硼替佐米(BOR)联合运用对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡的影响及其相关机制。探讨策略:1.采取MTT法检测Ad-NK4单用及与BOR联合运用对RPMI8226细胞增殖的抑制作用。2.采取PI流式细胞术检测各作用组RPMI8226细胞凋亡的影响。3.采取Western Blot技术检测各作用组RPMI8226细胞Cleed caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的变化。探讨结果:1. RPMI8226细胞分别按Ad-GFP组、Ad-NK4组、BOR组、Ad-GFP+BOR联合组及Ad-NK4+BOR联合组进行处理，采取MTT法测量各组在24h、48h和72h的细胞增殖情况。在24h时，以上各组的细胞增殖抑制率分别为6.65%、37.4%、27.1%、21.2%和68.5%。在48h时，以上各组的细胞增殖抑制率分别为0、52.6%、29.7%、34.6%和59.7%。在72h时，以上各组的细胞增殖抑制率分别为4.9%、59.7%、50.7%、41.3%和74.1%。在不同时间点，Ad-NK4与BOR联合作用组对RPMI8226细胞增殖抑制率均显著高于BOR单独作用组。2. Ad-NK4和BOR联合作用组RPMI8226细胞凋亡率（47.5%），显著高于Ad-NK4（12.1%）或BOR（14.5%）单独作用组。3. Westernblot结果显示：联合作用组RPMI8226细胞Cleed caspase-3和Bax蛋白水平均显著高于BOR或Ad-NK4单独作用组，而Bcl-2蛋白水平却相反，同时在联合作用组Bax/Bcl-2比率增加。结论： Ad-NK4可增强BOR对RPMI8226细胞增殖的抑制，增加RPMI8226细胞的凋亡，并且可能通过活化Caspase-3和上调Bax/Bcl-2比率的途径增强凋亡作用。关键词：NK4论文多发性骨髓瘤论文增殖论文粘附论文联合作用论文
中文摘要6-10
ABSTRACT10-15
前言15-20