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摘要：Poly (C)结合蛋白(PCBPs)是RNA结合蛋白,结合单链Poly (C)特异序列上的靶位点。该家族被分为两大类：即hnRNP K和PCBP1-4。这些蛋白主要参与转录后水平的各种调控(比如mRNA稳定性或翻译增强/沉默)。PCBPs包含三个KH结构域,两个连续的KH结构域在氨基端,第三个KH结构域在羧基端,被一个长度可变的中间序列分开。PCBPs通过它们的KH结构域识别和结合poly (C) RNA序列的能力对于它们在哺乳动物细胞中的功能是非常重要的。已有探讨报道该家族成员hnRNP K, PCBP1和PCBP2通过结合靶mRNA在各种人类肿瘤细胞中发挥重要作用。目前还没有任何文献报道该家族成员在人类神经胶质瘤细胞中的表达和作用。本论文对PCBP2在人神经胶质瘤中的表达,作用及其下游分子机制进行了初步探讨。我们利用Real-time PCR,Western Blot和免疫组织化学的策略检测了在神经胶质瘤细胞系和原发性肿瘤组织中PCBP2的表达变化,结果显示PCBP2在胶质瘤细胞系和原发性肿瘤组织中表达上调。为进一步探讨PCBP2可能的功能,我们合成了PCBP2siRNA,转染PCBP2siRNA到T98G、U87MG和U251神经胶质瘤细胞系中可以有效地干扰PCBP2的表达。此后,我们利用MTT和细胞计数发现敲低PCBP2可以抑制神经胶质瘤细胞增殖能力；我们还构建了PCBP2干扰重组腺病毒,用腺病毒进行裸鼠成瘤实验发现敲低PCBP2还能在体内抑制胶质瘤细胞的成瘤能力;利用BrdU掺入和流式细胞术的策略发现在神经胶质瘤细胞中敲低PCBP2后可以抑制细胞周期的进程并造成DNA合成的阻滞;利用Hoechst染色,TUNEL法和检测Caspase-3及其底物PARP的剪切产物发现敲低PCBP2可以诱导神经胶质瘤细胞发生Caspase-3通路介导的细胞凋亡。由此,我们初步推论PCBP2可能作为一个治疗神经胶质瘤的分子靶点。同时我们还发现,PCBP2在神经胶质瘤细胞中可能参与TGF-β1/Smads通路和P53通路的调控,具体分子机制还有待我们进一步探讨。在上面陈述的工作基础上,我们对PCBP2调控神经胶质瘤增殖、凋亡的分子机制进行了初步探讨。我们用RIP-Chip技术在胶质瘤细胞中筛选PCBP2的靶mRNA,通过三次重复实验一共得到35条候选靶mRNA.结合生物信息学预测,我们最后发现这35条mRNA中有9条含有PCBP2结合位点,其编码基因可能参与细胞周期或凋亡调控,并用Real-time PCR对芯片结果进行了初步验证。随后,我们用biotin pull-down对这条候选靶mRNA结合PCBP2的部位进行了确认,最终确定7条mRNA中的8个片段可以结合PCBP2。我们同时还发现FHL3mRNA的3’UTR的A段可以和PCBP2高度特异结合,并且进一步找到了它的核心识别序列。FHL3作为一个我们新发现的PCBP2靶基因,是FHL (four and a half LIM)家族的重要成员。FHL家族包括FHL1～FHL5共5个成员。它们的表达具有组织特异性。探讨发现,FHL参与转录调节、信号转导、凋亡等,是细胞生长、分化的重要调节因子。我们用Western Blot和免疫组化技术检测FHL3在神经胶质瘤组织和细胞中表达水平低于正常,敲低PCBP2可以增强FHL3蛋白表达水平,提示PCBP2可能反式调控FHL3表达。双荧光素酶报告基因实验和mRNA半衰期浅析证实在神经胶质瘤细胞中PCBP2可以通过影响FHL3mRNA稳定性,进而调节其蛋白水平。为了了解FHL3在胶质瘤细胞中的作用,我们在T98G胶质瘤细胞中过表达FHL3,发现胶质瘤细胞的增殖能力减弱,发生凋亡的细胞数目增加。同时敲低PCBP2和FHL3可以恢复肿瘤细胞的大部分的增殖能力,减少细胞的凋亡,说明敲低PCBP2可以通过上调FHL3抑制胶质瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡为了进一步探讨FHL3在胶质瘤细胞中的分子机制,我们用biotin pull-down结合质谱鉴定技术发现了包括PCBP2在内的22个蛋白都可以直接或间接地结合FHL3mRNA3'UTR。除此之外我们还发现,FHL3同家族成员FHL2,其蛋白水平可能受FHL3的负调控,但其mRNA水平不受影响。我们选择DNA基因芯片技术筛选在FHL3过表达的情况下T98G细胞内基因表达谱的变化。一共筛选到708个表达差别基因,其中420个表达下调,288个表达上调。根据生物信息学预测和相关文献报道,我们发现其中28个基因参与胶质瘤细胞的增殖,凋亡或侵袭。我们将Real-time PCR和芯片结果进行比较,最终在这28个基因中筛选出11个基因进行下一步验证。关于FHL3调节这些基因表达的具体分子机制还需要更多实验数据支持。本探讨首次揭示了PCBP2在神经胶质瘤中的重要作用。通过siRNA干扰技术,我们发现PCBP2展示出类似肿瘤原癌基因样的促胶质瘤生长和抗凋亡能力。FHL3作为我们新发现的一个受PCBP2负性调节的靶基因,通过其下游靶基因可以抑制胶质瘤生长,推动肿瘤细胞凋亡。这条PCBP2-FHL3-下游基因的新通路很可能成为探讨神经胶质瘤进展的重要线索。关键词：PCBP2论文FHL3论文siRNA论文RIP-Chip论文神经胶质瘤论文
中文摘要4-6
ABSTRACT6-9
前言9-14
实验材料与策略14-44
实验结果44-158
讨论158-171
不足与展望171-172
小结172-173