摘要：[探讨背景]LRR是与胶质瘤密切相关的脑组织特异性抑瘤基因,在胶质瘤组织和细胞中表达下调或缺失,LRR启动子化修饰是其失活的重要分子机制之一。外源性过表达LRR可抑制胶质瘤细胞生长,使胶质瘤细胞周期阻滞于G0/G1期,LRR可通过负性调控ERK/MAPK和PI-3K/T信号通路抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭。miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,能与靶基因的3’UTR区碱基不完全或完全配对,并在转录后水平抑制蛋白的翻译历程,甚至直接降解RNA而发挥负调控靶基因表达的作用。本课题用前期构建的外源性LRR表达的稳定转染胶质瘤细胞系U251/LRR和对照细胞系U251/Control,进行miRNA芯片浅析,筛选受LRR调控的差别miRNA,以miRNA的角度探讨LRR在胶质瘤中的抑瘤作用。[LRR调控的显著差别miRNA的GO浅析及其在胶质瘤中的预后浅析]miRNA芯片结果经qRT-PCR证实发现过表达LRR后下调2倍以上的miRNA4个(miR-182, miR-381, miR-15b, miR-487b),上调2倍以上的miRNA3个(miR-185, miR-155, miR-612)。通过LRR所调控miRNA的预测靶基因功能显著性浅析,构建了以LRR为核心的LRR-miRNA-靶基因调控网络图,以该图可以看出：LRR可以调控多个rniRNA的表达,一个rniRNA也可以调控多个靶基因的表达；而一个靶基因的表达也可以受多个rniRNA的调控。有趣的是rniRNA (miR-182、miR-381、miR-590-)和核心靶基因(LRR)之间有着着相互调控的联系。通过LRR调控的显著差别的miRNA(miR-182、 miR-381和niR-185)在胶质瘤细胞和组织中的表达发现,与正常脑组织相比,miR-182(?)(?) miR-381在胶质瘤组织和细胞中均呈现高表达,且miR-182或miR-381表达越高,患者预后越差,而miR-185在胶质瘤组织和细胞中显著下调,其表达越低,患者预后越差。[miR-182或miR-381是胶质瘤治疗的潜在生物靶点,干扰miR-182或rniR-381可通过调控靶基因LRR的表达,抑制BRD7(?)勺转录而抑制胶质瘤细胞的生长。其中,LRR-AP-2-miR-182-LRR调控环路在胶质瘤的发生进展中发挥了重要的作用]miRNA可以发挥瘤基因的作用参与胶质瘤细胞的增殖和生长。细胞和裸鼠皮下移植瘤实验表明,miR-182或miR-381可推动胶质瘤细胞生长,由此,miR-182或miR-381是胶质瘤治疗的潜在生物靶点。干扰miR-182或rniR-381通过上调磷酸化Rb、降低E2F3的表达将胶质瘤细胞阻滞于G0/G1期,抑制胶质瘤细胞生长。LRR作为胶质瘤抑瘤基因是miR-182和miR-381共同调控的靶基因。我们的探讨发现,miR-182, miR-381和BRD7均与LRR在正常脑组织及胶质瘤组织中的表达呈负相关。干扰miR-182或miR-381可通过上调靶基因LRR的表达,抑制LRR介导的ERK/MAPK和PI-3K/T信号通路调控AP-2/SP1/E2F6/C-Myc等转录因子与BRD7基因的结合,以而抑制BRD7的转录和表达,上调磷酸化Rb和下调E2F3的表达,将细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制胶质瘤细胞的生长,并诱导胶质瘤细胞向胶质样细胞分化。生物信息学预测并通过ChIP等实验证实转录因子AP-2正性调控miR-182的转录,结合前面证实在胶质瘤中miR-182抑制靶基因LRR的表达,LRR又可通过负性调控ERK/MAPK和PI-3K/T信号通路抑制转录因子AP-2的表达及转录活性,由此,在LRR, miR-182, AP-2之间形成了LRR-AP-2-miR-182-LRR调控环路参与胶质瘤的发生进展。[miR-185通过抑制靶基因DNMT1调控全基因组化水平,恢复LRR等高化基因在胶质瘤细胞中的表达,并通过抑制靶基因CD2和RhoA的表达而发挥抑瘤基因的功能。其中LRR-miR-185/SP1-DNMT1-LRR调控环路在胶质瘤的发生进展中发挥了重要的作用]miRNA也可作为抑瘤基因参与肿瘤的发生进展。MTT,细胞划痕,Transwell等实验证实miR-185可以抑制胶质瘤细胞的生长、运动和侵袭,而干扰miR-185能推动胶质瘤细胞的生长、运动和侵袭,因而miR-185可能在胶质瘤中可能发挥抑瘤基因的作用。为进一步阐明其作为抑瘤基因的功能,我们通过生物信息学预测并相关实验证实miR-185可抑制靶基因DNMT1的表达。DNMT1是维持化必须且最主要的一种DNA化转移酶,为此我们进一步运用Hplc-DAD检测发现过表达miR-185可抑制靶基因DNMT1下调全基因组化水平。通过MassArray, qRT-PCR实验证实过表达miR-185下调LRR, GAD1, PCDHA8, PCDHA13, SST, NKDD1A, HIST1H3, PHOX2B, SIX3等9个高化基因启动子化水平并恢复这9个高化基因在胶质瘤细胞中的表达。由此,iiR-185可通过抑制靶基因DNMT1调控全基因组化水平,而恢复LRR等高化基因的表达以而抑制胶质瘤细胞的生长与侵袭。根据GO浅析结果,miR-185主要参与Rho GTP酶活性,而CD2和RhoA是调控Rho GTP酶的主要分子。我们的实验证实CD2和RhoA是miR-185的直接调控靶基因,CD2或RhoA与miR-185在正常脑组织和胶质瘤组织中的表达呈负相关。我们的探讨表明,miR-185可通过直接抑制靶基因CD2和RhoA的表达,间接下调VEGFA的表达以而抑制胶质瘤细胞的生长与侵袭。在胶质瘤中LRR的过表达可显著上调miR-185的表达,而miR-185可通过抑制DNA化转移酶DNMT1调控全基因组化水平,以而上调LRR等高化基因的表达。因而在LRR, miR-185, DNMT1之间可形成LRR-miR-185-DNMT1-LRR调控环路参与胶质瘤的发生进展。另外我们证实SP1可正性调控DNA化转移酶DNMT1的表达,DNMT1可上调LRR的表达,而LRR又可通过负性调控ERK/MAPK和PI-3K/T信号通路抑制转录因子SP1的表达及转录活性。由此,在LRR, SP1, DNMT1之间可形成LRR-SP1-DNMT1-LRR调控环路参与胶质瘤的发生进展。总之,胶质瘤的发生进展是一个多基因参与、多阶段变异累积形成的病理历程。基因、miRNA.转录因子和DNA化修饰等在胶质瘤的发生进展历程中扮演重要角色,它们或相互支撑,或相互拮抗,以而构成胶质瘤发生进展历程中的复杂的调控网路。综合我们以上的探讨结果,我们在探讨LRR通过miRNA发挥抑瘤功能的同时,发现受LRR调控的miRNA也可以通过其直接调控的靶基因(如LRR)介导的信号转导通路调控转录因子与DNA的结合,或通过直接靶向DNA化转移酶而调控全化基因组水平,以而调控诸如LRR等高化基因的化水平和表达变化,以而在胶质瘤中形成了以LRR为核心的多相调控环路,即LRR-AP-2-miR-182-LRR、LRR-miR-185-DNMT1-LRR及LRR-SP1-DNMT1-LRR。这些调控环路在胶质瘤中形成了多个正性反馈的调节历程,参与胶质瘤的发生进展。关键词：LRR论文微小RNA论文胶质瘤论文转录因子论文DNA化转移酶1论文
摘要5-10
ABSTRACT10-16
目录16-18
主要缩略词简表18-19
第一章 前言19-24
LRR与脑胶质瘤19
miRNA与肿瘤19-21
转录因子、miRNA与基因之间的相互调控21-22
miRNA、DNA化转移酶与基因之间的相互调控22
本探讨技术思路22-23
技术路线23-24
第二章 材料与策略24-42
1 材料24-31
1.1 细胞系和组织样本24
1.2 实验动物24
1.3 菌株和质粒载体24-25
1.4 试剂25-30
1.5 主要仪器30-31
2 策略31-42
2.1 细胞RNA制备31-32
2.2 细胞蛋白抽提32-33
2.3 Western blot检测33-34
2.4 miRNA和si-RNA转染目的细胞34
2.5 MTT34
2.6 流式细胞浅析(FAM)细胞周期与细胞凋亡的变化34-35
2.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测35
2.8 免疫组化检测35-36
2.9 免疫荧光试验36
2.10 原位杂交检测miRNA的表达36-37
2.11 免疫组化和原位杂交结果浅析37
2.12 细胞划痕实验37
2.13 Transwell侵袭实验37-38
2.14 miRNA的靶基因验证38
2.15 EMSA检测(按照试剂盒说明书操作)38-39
2.16 ChIP检测(按照试剂盒说明书操作)39-40
2.17 Hplc-DAD检测全基因组化(GDM analysis)40
2.18 Gene-miRNA-Gene调控网络数据浅析40-41
2.19 裸鼠成瘤实验41
2.20 统计学浅析41-42
第三章 结果42-110
第一部分 以LRR为核心的LRR-miRNA-靶基因调控网络的构建42-55
1.1 LRR所调控的miRNA的筛选42-43
1.2 运用qRT-PCR对miRNA芯片结果进行验证43-44
1.3 LRR所调控miRNA的靶基因功能显著性浅析：GO-Analysis44-45
1.4 构建LRR所调控miRNA的靶基因功能调控网络：miRNA-GO调控网络45-47
1.5 构建以LRR为核心的LRR-miRNA-靶基因调控网络图47-48
1.6 LRR所调控的miRNA在胶质瘤细胞和组织中的表达以及与胶质瘤患者的预后浅析48-52
1.7 裸鼠皮下移植瘤实验进一步证实LRR下调miR-182、miR-381的表达,上调miR-185的表达52-55
第二部分 miR-182或miR-381作为胶质瘤治疗潜在生物靶点的作用机制及LRR-AP-2-miR-182-LRR调控环路的构建55-88
2.1 miR-182、miR-381是胶质瘤治疗的潜在生物靶点55-62
2.2 miR-182、miR-381作为胶质瘤生物靶点的作用机制62-85
2.3 LRR-AP-2-miR-182-LRR调控环路的构建85-88
第三部分 miR-185通过抑制靶基因DNMT1、CD2和RhoA发挥抑瘤功能及LRR-miR-185/SP1-DNMT1-LRR调控环路的构建88-110
3.1 过表达miR-185抑制胶质瘤细胞生长、增殖和侵袭88-91
3.2 miR-185通过靶向DNMT1调控全基因组化,恢复LRR等高化基因的表达91-99
3.3 miR-185通过调控靶基因CD2和RhoA间接下调VEGFA的表达抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭99-107
3.4 LRR-miR-185/SP1-DNMT1-LRR调控环路的构建107-110
第四章 讨论110-122
第一部分 以LRR为核心的LRR-miRNA-靶基因调控网络的构建110-112
第二部分 miR-182或miR-381作为胶质瘤治疗潜在生物靶点的作用机制及LRR-AP-2-miR-182-LRR调控环路的构建112-115
第三部分 miR-185通过抑制靶基因DNMT1、CD2和RhoA发挥抑瘤功能及LRR-miR-185/SP1-DNMT1-LRR调控环路的构建115-122
结论122-123
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