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摘要：目的：自然杀伤T细胞(Natural killer T cells, NKT细胞)是一类介导先天性免疫和获得性免疫的免疫细胞，在抗胞内菌的感染中发挥重要作用，能通过识别APC表面CD1d提呈的糖脂类抗原（脂类抗原为主）而被活化，进而发挥作用。细菌在体内外多种因素的作用下可发生细胞壁缺失，变异成为细菌L型，导致含有较多脂质成分的细胞膜外露，由此我们推想，与野生型相比细菌L型是否能更有效的活化NKT细胞？目前国内外已有许多关于活化后的NKT细胞对细菌的非特异性应答和特异性应答的探讨，但关于活化后的NKT细胞对细菌L型的应答探讨还很少。由此，我们选用一种兼性胞内寄生菌，即产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)，用青霉素诱导其成为L型，并通过尾静脉注射感染C57BL/6小鼠，分别建立野生型和L型感染的动物模型，通过检测感染小鼠肝脏和脾脏中野生型和L型细菌数（Colony-Forming Units, CFU）观察小鼠免疫系统对李斯特菌L型和野生型清除能力的差别；利用流式细胞仪检测LM野生型和L型感染小鼠后不同时间点肝、脾中NKT细胞的活化比例及绝对数，探讨细菌L型对NKT细胞的活化与野生型的差别；用酶联免疫吸附法测量不同模型中IFN-γ和IL-4在血清中的含量，比较LM及其L型感染小鼠后体内细胞因子分泌量的区别。策略：1．用青霉素诱导LM成为L型，调整野生型和L型LM的终浓度为2×105CFU/ml；2．通过比较几种分离策略对肝脏淋巴细胞、NKT、NK细胞比例和细胞绝对数的影响，明确不同肝脏淋巴细胞分离法的适用范围；3．分别用PBS、野生型和L型LM0.2ml尾静脉注射感染C57BL/6小鼠，建立动物感染模型，每组4只；4．感染后第3天无菌分离肝脏和脾脏，检测各组肝脏和脾脏中LM野生型和L型的CFU；5．感染后第1、3天分别分离小鼠肝脏和脾脏的淋巴细胞，采取流式细胞仪检测各组小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞中CD3+NK1.1+NKT、CD3+NK1.1+CD4+NKT、CD3-NK1.1+NK细胞的比例及绝对数；6．摘眼球获取各组小鼠的外周血，采取酶联免疫吸附法检测各组小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量。结果：1．经过青霉素纸片法诱导获得L型LM，在L型培养基中形成油煎蛋样菌落，革兰染色见部分细菌由革兰阳性转变为革兰阴性，呈多形性；细胞壁染色见细胞壁缺失所致菌体内浓染；2．小鼠肝脏淋巴细胞分离策略中，肝脏的预处理会影响淋巴细胞的获取率，不放血法获得的总淋巴细胞绝对数、T细胞比例和绝对数最高；摘眼球放血结合体循环灌流法获得的总淋巴细胞比例最高；摘眼球放血法获得的CD3+NK1.1+NKT、CD3-NK1.1+NK细胞比例最高。同时，不同的Percoll分离策略也影响各种淋巴细胞的获取，非连续密度梯度法（33%+70%Percoll）获得的淋巴细胞、T细胞、CD3+NK1.1+NKT、CD3-NK1.1+NK细胞比例均高于33%组；3．L型感染组小鼠在感染后第3天肝脏和脾脏的L型CFU数均显著低于野生型感染组；4．在感染后的第1天和第3天，比较小鼠肝脏淋巴细胞中的CD3+NK1.1+NKT、CD3+NK1.1+CD4+NKT、CD3-NK1.1+NK细胞的比例和绝对数发现，L型感染组的上面陈述的细胞均高于野生型感染组；2个感染组的上面陈述的细胞中，除了第1天CD3+NK1.1+CD4+NKT细胞的比例外，其它细胞各项数值均高于未感染组；其中CD3+NK1.1+NKT、CD3-NK1.1+NK细胞的比例和绝对数在第3天较第1天略有下降，野生型和L型感染组CD3+NK1.1+CD4+NKT的绝对数在第1天和第3天均升高，而第3天较第1天下降，但其比例在L型组中第3天升高，野生型组在第1天下降，第3天升高。5．比较小鼠脾脏内CD3+NK1.1+NKT和CD3-NK1.1+NK细胞比例和绝对数，发现L型组均高于野生型组，而且2个感染组均高于未感染组，与肝脏中不同的是这2种细胞的比例和绝对数在第3天均高于第1天。与未感染组相比，2个感染组小鼠脾脏中CD3+NK1.1+CD4+NKT细胞的比例在感染后第1天时升高，第3天较未感染组低，但是其绝对数在第1和第3天均高于未感染组。L型感染组在感染第1天CD3+NK1.1+CD4+NKT细胞比例高于，但是在第3天却低于野生型组，而细胞绝对数却均高于野生型组。6．ELISA检测感染小鼠外周血分泌的IFN-γ和IL-4的分泌情况，结果显示随着感染时间的增加，血清中IFN-γ水平不断增加，且L型组高于野生型；而随着感染时间的增加，血清中的IL-4水平先增加后降低，且L型组比野生型组更低。结论：1．采取摘眼球放血结合心脏灌流的策略获得肝脏单个核细胞悬液，然后采取非连续密度梯度离心法分离淋巴细胞，可获得较大比例的肝脏淋巴细胞及其亚群。2．在小鼠的肝脏和脾脏中，感染的李斯特菌L型比野生型更容易被清除。3．李斯特菌L型能更有效的刺激CD3+NK1.1+NKT、CD3+NK1.1+CD4+NKT、CD3-NK1.1+NK细胞的增殖，这可能是细菌L型更容易被清除的理由之一。4．肝脏作为固有免疫器官，在抗李斯特菌及其L型感染的非特异性免疫历程中，肝脏中的NKT和NK细胞在感染早期发挥作用的高峰比在脾脏更早。5．在抗李斯特菌及其L型感染中，肝脏中活化后的CD3+NK1.1+NKT细胞可能以CD3+NK1.1+CD4+NKT亚群发挥主要作用，而脾脏中则以CD3+NK1.1+CD4-NKT为主。6．与李斯特菌野生型相比，L型感染能诱发机体的免疫系统产生更多的IFN-γ发挥抗感染作用。关键词：NKT论文NK论文LM论文L型论文流式细胞术论文
中文摘要5-7
英文摘要7-10
引言10-13
材料与策略13-21
结果21-38
讨论38-41
结论41-42