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摘要：目的：建立特异、快速、敏感的实时荧光PCR熔解曲线基因分型策略,并探讨该法在临床痰标本和环境水样中鉴定嗜肺军团茵的运用价值。策略：(1)根据嗜肺军团菌16S rRNA基因保守序列设计引物和淬灭FRET探针建立实时荧光PCR熔解曲线策略。(2)优化引物与探针浓度,用嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他病原菌标准菌株验证该策略的特异性、敏感性和重复性,并做模拟实验。(3)117份痰标本进行实时荧光PCR熔解曲线法鉴定,鉴定结果通过基因测序法检测结果验证。(4)对18份环境水样进行培养,生化表型,普通PCR,实时荧光PCR熔解曲线鉴定,鉴定结果通过基因测序法检测结果验证。结果：(1)引物序列：上游引物5'-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3'.下游引物5'-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3'。探针序列：锚定探针序列5'-CCCATACTCGAGTCAACC (FAM)-3',感应探针序列5'-(BHQ1) TATTATCTGACCGTCCCA G (ph)-3'(2)优化后的反应系统：10×PCR酶系统15.5μ1,上游引物(40.0pmol/μL)1.0μl,下游引物(2.0pmol/.μl)2.0μl,锚定探针(10pmol/μl)1.0μl,感应探针(10pmol/μl)0.5μl,模板5μ1。优化后的反应程序：(Roche Lightcycler480实时荧光PCR仪)95℃3min:95℃10s,57℃20s,72℃30s,50个循环;熔解浅析程序为95℃1min:40℃2min40℃升温至85℃,1℃/5s。FAM通道下检测荧光。利用实时荧光PCR熔解曲线基因分型策略检测的15株嗜肺军团菌、30株非嗜肺军团茵、7株其他病原菌中,15株不同血清型的嗜肺军团菌Tm值均为57℃;7株非嗜肺军团菌Tm值为43℃,1株Tm值为45℃；其余22株非嗜肺军团菌和7株其他病原茵均无显著Tm值。该策略检测的灵敏度可达100fg/μl。(3)117例痰标本经培养未发现嗜肺军团菌阳性。117例痰标本中经实时荧光PCR熔解曲线基因法检测,发现有3例嗜肺军团茵,与基因测序法检测结果一致。(4)环境水样经培养,得到可疑军团菌22株,经普通PCR鉴定,发现20株军团菌阳性。环境水样经培养,22株可疑军团菌菌株经实时荧光PCR熔解曲线法鉴定嗜肺军团菌阳性的菌株共9株。与基因测序法检测结果一致。环境水样直接提取DNA,普通PCR后军团菌阳性的标本：4号,5号,8号,9号,13号,14号.15号.16号,17号,18号,经基因测序法验证后,进一步显示5、9号标本为嗜肺军团菌,13、14、15号标本为辛辛那提军团菌,16、17、18号标本为长滩军团菌。环境水样直接提取DNA、实时荧光PCR熔解曲线法鉴定嗜肺军团菌阳性标本：未发现阳性标本。结论：(1)建立的实时荧光PCR熔解曲线法能够明确的对嗜肺军团菌鉴定,并可对部分军团菌进行分型。(2)在对117例临床标本的鉴定中,检测出3例嗜肺军团菌,鉴定结果与PCR-基因测序策略一致。(3)对环境水样检测历程中,通过采取分离培养、生化表型、实时荧光PCR熔解曲线法、基因测序策略的鉴定,发现环境水源能分离出军团菌,对分离菌株进一步的分型和鉴定,可采取实时荧光PCR熔解曲线法、基因测序策略。(4)实时荧光PCR熔解曲线法除具有传统实时荧光PCR高灵敏、高特异性、高精确度及污染小等优点外，淬灭探针荧光标记技术要求低,更便宜,耗时短,由此,该策略更适用于军团菌病的预防和临床诊断,尤其是在军团菌病暴发流行时,可提供快速的实验室诊断。关键词：嗜肺军团菌论文实时荧光PCR熔解曲线论文淬灭FRET探针论文感染论文分子分型论文
中文摘要4-6
Abstract6-10
符号说明10-11
前言11-17
探讨近况、成果11-16
探讨目的、策略16-17
材料和策略17-25
1 材料17-19
1.1 标准菌株来源17
1.2 环境水源标本采集和处理17-18
1.3 临床标本采集和处理18
1.4 主要试剂和仪器18-19
2策略19-25
2.1 军团菌分离培养19
2.2 军团菌表型及生化试验19-20
2.3 DNA提取20-21
2.4 实时荧光PCR熔解曲线鉴定军团菌策略的建立21-23
2.5 环境水源标本及临床痰标本的实时荧光PCR熔解曲线直接检测23
2.6 环境水源标本分离菌株的实时荧光PCR熔解曲线鉴定23
2.7 基因测序法验证23-25
结果25-35
1 军团菌形态观察25
2 生化试验结果25-26
3 实时荧光PCR熔解曲线法评估26-31
3.1 引物与探针优化26-27
3.2 特异性27-29
3.3 敏感性29-30
3.4 重复性30-31
3.5 模拟实验结果31
4 环境水样和临床标本的鉴定结果31-35
4.1 环境水样的鉴定结果31-32
4.2 环境水源分离菌株的鉴定结果32-33
4.3 临床标本的鉴定结果33-35
讨论35-41
1 军团菌分离培养35
2 军团菌生化表型鉴定35-36
3 军团菌实时荧光PCR熔解曲线法鉴定36-39
4 实时荧光PCR熔解曲线法鉴定39-41