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摘要：目的：在既往运用清络通痹颗粒(QTL)治疗类风湿关节炎(RA)有效的基础上,拟进一步以分子水平探讨QTL对RA破骨细胞(OC)分化相关因子的影响,为进一步揭示QLT对RA中OC骨吸收的信号通路机制奠定基础。策略：采取外周血单核细胞体外培养法,建立滑膜成纤维细胞-单核细胞共培养模型。将传代至3-5代的关节炎大鼠滑膜成纤维细胞消化,用含胎牛15%的α-MEM制备成浓度为0.5-1.０*10^6／ml的细胞悬液备用,将悬挂式小室置于含有单核细胞混悬液的6孔板上,再将成纤维细胞悬液加入小室内。6孔板置5%C02培养箱中37°C培养,用M-C作为诱导剂,诱导生成具有典型OC特点的破骨样细胞(OCL),并进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定。在显微镜下可见：细胞形态清晰,呈不规则形,多核(4-10个不等),苏木素染色呈红色或者棕红色颗粒的部分为TRAP酶活性的部位所在,由此鉴定共培养所生成的TRAP阳性的多核细胞(3核以上)为OCL,符合公认的OC鉴定标准。证明本次实验建立的共培养系统可以成功诱导出具有骨吸收功能的OC。在共培养至第3天、第11天和第21天时,6孔细胞培养板内各组细胞给药,各组设3个平行对照,培养48小时后收集细胞上清液,用于RANKL和IL-34、OPN的测定。将上清于96孔细胞培养板中测定RANKL和IL-34、OPN含量,每组做4个平行对照,策略按照各个试剂盒操作。ELISA法测定含药血清对RA破骨细胞分化因子RANKL及破骨细胞分化相关因子IL-34、OPN的影响。结果：一定剂量的QLT含药血清可抑制RA破骨细胞培养上清中RANKL和IL-34、OPN的含量,使OC分化、增殖活性减弱,这说明QLT对OC的生长有直接的抑制作用。结论：QLT通过抑制RANKL上游分泌的炎症细胞因子(IL-34、OPN等),以而介导RANKL这一OC分化关键因子的过度表达,减轻了RA关节软骨及软骨下骨破坏,延缓骨质破坏的进程。关键词：清络通痹颗粒论文破骨细胞论文共培养论文
目录6-8
摘要8-9
Abstract9-11
前言11-12
第一部分 文献综述12-21
1.1 类风湿关节炎探讨进展12-14
1.1.1 西药治疗探讨12-13
1.1.2 中药治疗探讨13-14
1.2 破骨细胞分化相关因子在类风湿关节炎中的重要作用14-17
1.2.1 破骨细胞14-15
1.2.2 影响破骨细胞分化的细胞因子15-17
1.3 清络通痹颗粒治疗类风湿关节炎探讨概述17-21
1.3.1 临床探讨18-19
1.3.2 实验探讨19-21
第二部分 滑膜成纤维细胞-单核细胞共培养诱导破骨细胞生成及鉴定21-27
2.1 实验材料21-22
2.1.1 实验动物21
2.1.2 实验药品与试剂21
2.1.3 实验仪器21-22
2.2 实验策略22-24
2.2.1 滑膜成纤维细胞的制备22
2.2.2 滑膜成纤维细胞的培养22
2.2.3 外周血淋巴细胞分离22-23
2.2.4 滑膜成纤维细胞-单核细胞共培养系统的建立23-24
2.3 实验结果24-25
2.4 讨论25-27
第三部分 清络通痹颗粒对破骨细胞分化因子及细胞因子IL-34、骨桥蛋白表达的影响27-33
3.1 实验材料27
3.1.1 实验动物27
3.1.2 实验药品与试剂27
3.1.3 实验仪器27
3.2 实验策略27-30
3.2.1 含药血清的制备27-28
3.2.2 分组与给药28
3.2.3 RANKL检测28
3.2.4 IL-34检测28
3.2.5 OPN检测28
3.2.6 ELISA法检测RA破骨样细胞RANKL和IL-34、OPN上清的表达28-30
3.2.7 统计策略30
3.3 实验结果30-31
3.4 讨论31-33
第四部分 结论33-34