摘要：香鳞毛蕨是一种具有特殊香气的多年生草本植物,其特点是老叶宿存,系鳞毛蕨科鳞毛蕨属。香鳞毛蕨主要分布于亚洲温带、欧洲和北美洲,通常生长在岩屑坡和岩石的裂缝中。特别是在五大连池分布的香鳞毛蕨,其只生长于火山喷发后所形成的熔岩环境中,当地居民用它来治疗多种皮肤病(牛皮癣、痤疮、皮疹和皮炎),民间验方利用香鳞毛蕨已有几十年的历史。此外,香鳞毛蕨还具有抗菌、镇痛、抗氧化、抗肿瘤和治疗类风湿性关节炎的作用。本论文对香鳞毛蕨的精油和类成分进行了分离提取,并对纯化出的成分进行了抗菌活性考察。探讨结果如下：1.建立了香鳞毛蕨精油以及4种类成分的浅析策略。(1) GC-MS结合保留指数对香鳞毛蕨精油成分进行了鉴定,共鉴定了18个成分,占精油总量的89.65%,结果表明香鳞毛蕨精油富含倍半萜类化合物。(2)确定了RP-Hplc同时柃测香鳞毛蕨中4种类成分的色谱条件。色谱柱为ODS C18色谱柱(100mm×4.6mm.i.d.,2.6μm),流动相为乙腈-水-甲酸,柱温为25℃。本策略重复性好、准确度高、稳定性强,适用于香鳞毛蕨及其他植物中香鳞毛蕨素等类成分的浅析及检测。2.采取无溶剂微波萃取技术对香鳞毛蕨中的精油进行了提取,中心组合设计结合响应而浅析优化提取工艺,考察了提取时间、辐射功率和含水率对提取率的影响,确定了最佳的提取工艺参数：提取时间：34min辐射功率：500w含水率：50%在上面陈述的条件下对香鳞毛蕨精油进行提取,精油的平均提取率为0.33%,其R.S.D.为5.19%。响应面浅析结果表明,在各影响因素中,提取时间对香鳞毛蕨精油提取率的影响最大,其次是辐射功率,最后是含水率。提取率与试验因素之间并不是简单的线性联系,对香鳞毛蕨精油提取率有较强交互作用的是提取时间和辐射功率。无溶剂微波提取法实现了香鳞毛蕨精油的高效提取,精油提取后的材料可继续用于其它目标成分的提取。3.采取负压空化提取法对香鳞毛蕨中类成分进行提取。考察了液固比、提取时间、空气流量、压力、提取次数等因素对负压空化提取历程中类成分提取率的影响,确定了最佳工艺参数：液固比：10：1(mL/g)提取时间：20min空气流量：30mL/min压力：-0.04～-0.05MPa提取次数：3次在上面陈述的条件下,香鳞毛蕨素、绵马酚、绵马素PB和绵马素BB的提取率均达到94%以上。由于负压空化提取技术以负压为动力,提取历程在密闭系统和常温操作系统下进行,所以这一策略具有节能效果好,无有机溶剂释放,有效成分无高温降解发生等优点,适用于香鳞毛蕨以及其他植物中活性成分的高效提取。4.对香鳞毛蕨中绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的分离富集策略进行了探讨。(1)采取树脂柱吸附技术对香鳞毛蕨中的绵马酚和绵马素PB的分离富集进行了探讨,洗脱流程为：5BV30%乙醇溶剂用于移除杂质,10BV50%乙醇溶剂被用于收集绵马酚,15BV70%乙醇溶液用来富集绵马素PB,沈脱流速为2BV/h。(2)采取树脂柱色谱技术对香鳞毛蕨中的香鳞毛蕨素和绵马素BB的分离富集进行了探讨,对HPD-826,AB-8和HPD-600三种树脂的分离性能进行了考察,结果表明AB-8树脂对香鳞毛蕨素和绵马素BB的分离性能较好。确定了最佳洗脱流程为：10BV70%乙醇溶剂用于移除杂质,30BV80%乙醇溶剂被用于收集香鳞毛蕨素,20BV95%乙醇溶液用来富集绵马素BB,洗脱流速为6BV/h。(3)经过树脂富集后,绵马酚的含量以1.40mg/g增加到了10.4mg/g,提升了7.4倍；绵马素PB在产品中的含量以4.9mg/g增加到了41.8mg/g,增加了8.52倍。他们的回收率分别为85.73%和78.41%。采取AB-8树脂柱色谱动态分离后,香鳞毛蕨素的含量以4.10mg/g增加到了34.4mg/g,提升了8.39倍：绵马素BB在产品中的含量以9.5mg/g增加到了56.9mg/g,增加了5.99倍。他们的回收率分别为91.22%和75.64%。5.采取中压硅胶柱层析及重结晶技术对香鳞毛蕨中绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB进行了纯化,并采取一系列策略对纯化所得化合物结构进行了确认。(1)确定了香鳞毛蕨样品中绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的中压硅胶柱层析分离策略以及重结晶条件。经Hplc检测表明绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的纯度依次为96.2%,95.1%,97.7%和95.3%。回收率依次为78.26%,63.27%,73.24%和65.63%。(2)经纯化得到具有一定纯度的化合物,通过理化性质、紫外(UV)、质谱(ESI-MS-MS)与核磁共振谱('H-NMR和13C-NMR)技术,结合文献报道信息确定所得产品为目标化合物。6对香鳞毛蕨不同溶剂萃取物、纯化得到的4种类成分以及香鳞毛蕨精油的抗菌活性进行了初步探讨,探讨结果如下：(1)考察了不同极性溶剂萃取物的抗菌活性,受试菌种包括痤疮杆菌、金葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌。不同极性部位对细菌和真菌都具有较好的抑制作用,其中对石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水这四种极性溶剂萃取物最为敏感的菌株是大肠杆菌,其最小抑菌浓度分别为1.95,1.95,3.9和3.9mg/mL。(2)香鳞毛厥精油对痤疮杆菌的最小抑菌浓度为0.0391%(v／v),香鳞毛蕨精油的最小杀菌浓度为0.0782%(v/v)。香鳞毛蕨精油对痤疮杆菌的抑菌活性优于文献报道的迷迭香精油,与J‘香精油抑制痤疮杆菌的活性相当。(3)对香鳞毛蕨中4种类成分较为敏感的菌株是表皮葡萄球菌,金葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌、白色念珠菌和痤疮杆菌。香鳞毛蕨素对白色念珠菌的最小杀菌浓度为125μg/mL,杀菌效果与氯霉素相当,优于红霉索和青霉素。绵马酚、绵马素PB和绵马素BB对表皮葡萄球菌、金葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌和白色念珠菌的杀菌效果与阳性对照相当或优于阳性对照。香鳞毛蕨素、绵马酚、绵马素BB和绵马素PB对痤疮杆菌的最小抑菌浓度分别为15.63,15.63,31.25和125μg/mL。(4)绵马素BB的动态杀菌曲线表明浓度为MBC(2MIC)的绵马素BB对瘁疮杆菌在5小时内可以将细菌全部杀灭。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)探讨了绵马素BB对痤疮杆菌的蛋白表达量的变化,结果表明绵马素BB可能通过抑制26kDa和33kDa两种特异蛋白而起作用。采取琼脂糖凝胶电泳探讨了绵马素BB对痤疮杆菌DNA的裂解作用,结果表明浓度MBC的绵马素BB作用痤疮杆菌能导致其DNA出现碎裂。综上所述,无溶剂微波萃取技术和负压空化提取技术适用于香鳞毛蕨中精油及类成分的提取。树脂柱吸附和树脂柱色谱可以有效地分离富集香鳞毛蕨中四种主要的类成分,纯化后,绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的纯度分别达到96.2%,95.1%,97.7%和95.3%,总回收率为46.07%,36.63%,45.80%和38.66%。香鳞毛蕨不同极性溶剂萃取物和纯化得到的类成分均具有抑菌效果。对绵马素BB抑制痤疮杆菌的分子机制进行了初步的探讨,为进一步开发利用植物药提供了良好的基础。关键词：香鳞毛蕨论文精油论文类成分论文负压空化提取论文柱层析论文分离纯化论文抗菌活性论文
摘要3-6
Abstract6-16
1 绪论16-32
1.1 香鳞毛蕨的探讨进展16-22
1.1.1 生物学特性16-17
1.1.2 资源分布17
1.1.3 化学成分17-21
1.1.4 药理作用21-22
1.2 精油的提取22-23
1.2.1 传统提取法22-23
1.2.2 微波萃取23
1.3 类成分的提取23-25
1.3.1 常规提取技术24
1.3.2 负压空化提取技术24-25
1.4 分离纯化25-28
1.4.1 溶剂分离法26
1.4.2 柱色谱法26-27
1.4.3 结晶和重结晶法27
1.4.4 结构鉴定27-28
1.5 天然药物抗菌活性探讨28-30
1.5.1 微生物概况28
1.5.2 抗菌药物及细菌的耐药机制28-29
1.5.3 抗菌植物药探讨进展29-30
1.6 本探讨的目的和作用30-32
2 香麟毛蕨中精油及间苯三酣类成分浅析策略的建立32-42
2.1 香鳞毛蕨精油的气相-质谱浅析策略32-35
2.1.1 实验部分32-33
2.1.2 结果与讨论33-35
2.2 香鳞毛蕨中类成分浅析策略35-41
2.2.1 实验部分36-37
2.2.2 结果与讨论37-41
2.3 本章小结41-42
3 香鳞毛蕨精油提取工艺的探讨42-49
3.1 实验材料和仪器42-43
3.2 样品的制备43
3.3 Hplc浅析43
3.4 实验设计43-44
3.5 扫描电镜条件44
3.6 结果与讨论44-48
3.6.1 模型的拟合44-45
3.6.2 响应面浅析45-46
3.6.3 不同提取策略的比较46-47
3.6.4 提取前后材料中其它成分含量的变化47-48
3.7 本章小结48-49
4 香鳞毛蕨类成分提取工艺的探讨49-57
4.1 实验部分49-51
4.1.1 实验材料与仪器49-50
4.1.2 HPLC浅析策略50
4.1.3 负压空化提取50
4.1.4 不同提取策略浅析样品的制备50-51
4.1.5 提取率的计算51
4.2 结果与讨论51-55
4.2.1 负压空化提取条件的优化51-54
4.2.2 不同提取策略的比较54-55
4.3 本章小结55-57
5 香鳞毛蕨中类成分富集策略的建立57-72
5.1 实验部分57-62
5.1.1 实验材料与仪器57-58
5.1.2 大孔吸附树脂58-59
5.1.3 绵马酚和绵马素PB的大孔树脂分离富集59-60
5.1.4 香鳞毛蕨素和绵马素BB的大孔树脂分离富集60-62
5.2 结果与讨论62-70
5.2.1 绵马酚和绵马素PB的大孔树脂分离富集62-63
5.2.2 香鳞毛蕨素和绵马素BB的大孔树脂分离富集63-70
5.3 本章小结70-72
6 香鳞毛蕨中类成分的纯化72-84
6.1 实验部分72-74
6.1.1 实验材料与仪器72
6.1.2 Hplc检测条件72-73
6.1.3 中压硅胶柱层析分离纯化73-74
6.1.4 结晶与重结晶74
6.1.5 结构的确认74
6.2 结果与讨论74-83
6.2.1 纯化结果74-76
6.2.2 结构的确认76-83
6.3 本章小结83-84
7 香鳞毛蕨抗菌活性的初步探讨84-96
7.1 实验材料与仪器84-87
7.1.1 实验菌种85
7.1.2 培养基的配制及菌株的培养条件85
7.1.3 菌液配制及计数85-86
7.1.4 样品的制备及药品溶液的配制86
7.1.5 聚丙烯酰胺凝胶的制备86-87
7.1.6 琼脂糖凝胶的配制87
7.2 实验策略87-89
7.2.1 最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)的测定87-88
7.2.2 绵马素BB的杀菌动态测定88
7.2.3 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳测定88-89
7.2.4 琼脂糖凝胶电泳测定89
7.3 结果与讨论89-94
7.3.1 抗菌活性评估89-92
7.3.2 绵马素BB的动态杀菌结果92
7.3.3 SDS-PAGE检测绵马素BB对痤疮杆菌的蛋白质含量的影响92
7.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测绵马素BB对痤疮杆菌DNA含量的影响92-94
7.4 本章小结94-96
结论96-99
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