摘要：钩端螺旋体病(Leptospirosis,简称钩体病)是一种全球分布的、洪涝时重点监控的自然疫源性传染病,是我国重点防疫和监控的主要传染病之一。致病钩体赖株基因组中有着众多编码溶血素的基因表明溶血素在钩端螺旋体病中发挥重要作用,但溶血素在钩体感染巨噬细胞后基因表达水平和分泌性尚未阐明。本探讨中采取T-A克隆等分子生物学策略构建钩体溶血素基因sphl (LA1027)、 sph2(LA1029)、sph3(LA4004)、sph4(LA3050)、 hlpA(LA1650)、 hly(LA3937)、 hlyX(LA0378)和tlyA(LA0327)的原核表达系统及Ni-NTA亲和层析法提纯各重组溶血素蛋白,分光光度法检测重组溶血素蛋白对绵羊红细胞的溶血活性,实时荧光定量PCR检测钩体赖株感染THP-1和J774A.1细胞后溶血素基因mRNA水平变化及Western-blot检测感染这两种细胞后溶血素蛋白的分泌性。结果成功地构建了8个高效表达目的重组蛋白的表达系统及重组蛋白具备不同程度的溶血活性,感染巨噬细胞后8个溶血素基因水平上调,其中以sph2和hlpA上调更为显著,在两种细胞中rSphl、 rSph2、 rSph3、 rH1pA和rT1yA均能够分泌到胞外。这为后续深入探讨8个溶血素的致病机理奠定了良好的基础。人感染致病性钩端螺旋体后可引起严重的全身性炎症反应,但是钩体病人血清中完整的炎症因子谱未见报道。钩体赖株基因组中有着众多编码溶血素的基因表明溶血素在钩端螺旋体致病中发挥作用,但关于钩端螺旋体溶血素能否诱导炎性细胞因子分泌及相关的信号通路探讨未见报道。本探讨中,采取炎性相关细胞因子抗体芯片技术检测钩体病人和感染钩体后的小鼠血清中的完整炎性因子谱。与钩体病人血清相比,感染的小鼠血清中细胞因子出现相对较低的水平,而IL-1β,IL-6和TNF-α三种促炎性细胞因子是钩体病人和感染后小鼠血清均升高的细胞因子。钩端螺旋体重组鞘磷脂类溶血素蛋白(rSph1-rSph4)和非鞘磷脂类溶血素蛋白(rH1pA、rH1yC、rH1yX和rT1yA)均可诱导入和小鼠巨噬细胞分泌IL-1β,IL-6和TNF-α,但在小鼠巨噬细胞中水平相对较低。TLR2和TLR4受体封闭后,溶血素诱导人和小鼠巨噬细胞释放IL-1β,IL-6和TNF-α的能力减弱,这一结论在TLR敲除小鼠的单核巨噬细胞中也得到验证。胞内信号通路NF-κB和JNK抑制剂处理后,人和小鼠巨噬细胞在溶血素刺激下释放上面陈述的三种细胞因子的能力减弱。本探讨发现8个钩端螺旋体重组溶血素蛋白能通过TLR2和TLR4受体介导的JNK和NF-κB途径诱导人和小鼠巨噬细胞分泌炎性细胞因子。为了探讨钩端螺旋体(简称钩体)侵入人或鼠单核-巨噬细胞方式及其吞噬泡形成差别性。本探讨中采取透射电镜观察钩体赖株侵入小鼠单核-巨噬样细胞J774A.1和佛波酯(PMA)激活的人单核细胞THP-1后吞噬泡形成情况。采取免疫荧光联合激光共聚焦显微镜及荧光分光光度仪等策略,观察细胞内吞抑制剂单丹磺酰尸胺(MDC)、氧化酚砷(PAO)阻断及网格蛋白抗体封闭前后,J774A.1细胞和THP-1细胞内钩体赖株数量的变化。结果发现774A.1细胞内钩体有着于吞噬泡内,THP-1细胞内钩体无吞噬泡膜包绕。MDC和PAO能以剂量依赖方式抑制J774A.1和THP-1细胞内吞钩体,其中10μmol/L以上MDC和1μmol/L以上PAO阻断的J774A.1和THP-1细胞内钩体数量显著少于未阻断细胞(P0.05)。网格蛋白抗体封闭后,J774A.1和THP-1细胞内钩体数量也显著减少(P0.05)。以上面陈述的结果中得出如下结论：钩体以网格蛋白依赖性内吞途径侵入人或鼠单核-巨噬细胞。人或鼠单核-巨噬细胞内钩体吞噬泡形成有显著差别,这可能是人或鼠感染钩体后发病情况不同的理由之一。钩体病是由致病性钩体引起的全世界流行的共患病,但致病性钩体感染人和家禽(或野生动物)的症状不同。钩体在感染人和动物时迅速通过皮肤和粘膜进入血流,吞噬历程是最重要的天然免疫防护机制之一,由此单核细胞和巨噬细胞在清除侵入病原菌的吞噬功能对钩体感染的天然免疫保护中起到关键作用。钩体与人和小鼠巨噬细胞相互作用的结局不一样,大多数进入小鼠原代与传代细胞的钩体局限在吞噬泡内,而感染人原代与传代巨噬细胞内大多数钩体分布在细胞质内,且不被吞噬泡膜所包裹；含钩体的小鼠吞噬细胞膜能够与溶酶体融合而被杀灭,但人巨噬细胞内钩体反而有繁殖的迹象。新生的吞噬体缺乏将病原体或摄入物质杀死降解的能力,以吞噬体产生到成为具有杀死并降解被吞噬物的吞噬溶酶体的历程称为吞噬体的成熟。微生物的逃逸机制是通过寄生在巨噬细胞内的吞噬体中的细菌,干扰内体的发生和成熟,导致形成的吞噬体不能获得溶酶体性质。致病性钩体感染人巨噬细胞后是如何逃逸宿主天然防疫系统而在其内存活和繁殖以及钩体溶血素是否参与此干扰吞噬体成熟的历程,均未见报道。本探讨中,我们通过透射电镜对THP-1和J774A.1细胞中吞噬泡的形成及演变的探讨,结果发现THP-1和J774A.1细胞在内吞开始均形成吞噬泡膜,THP-1中吞噬泡膜出现消失的历程,但J774A.1细胞中的吞噬泡膜没有出现消失的历程。通过对THP-1和J774A.1细胞吞噬泡成熟历程中的表面标志分子进行免疫荧光及激光共聚焦观察,结果显示THP-1细胞中,溶血素主要与吞噬泡膜早期标志物(Rab5)共定位,与晚期标志物(Rab7和LAMP-1)共定位较少；J774A.1细胞中,溶血素可与不同时期吞噬泡膜表面标志物发生共定位。上面陈述的结果初步得出钩体溶血素能够与吞噬泡膜发生作用,通过溶解吞噬泡膜参与干扰吞噬泡成熟的历程,以而介导钩体逃逸人巨噬细胞的吞噬杀灭作用。这可能是人或鼠感染问号钩体后发病情况不同的理由之一关键词：钩端螺旋体论文溶血素论文基因克隆论文原核表达论文溶血活性论文RT-PCR论文钩端螺旋体论文炎症因子芯片论文溶血素论文炎症因子论文Toll样受体论文信号通路论文钩端螺旋体论文单核-巨噬细胞论文内吞论文单丹磺酰尸胺论文氧化酚砷论文网格蛋白抗体论文内吞阻断论文钩端螺旋体论文溶血素论文吞噬体论文吞噬泡成熟论文吞噬泡膜分子标志论文免疫逃逸论文
致谢5-6
第一部分6-9
中文摘要（一）6-7
Abstract (1)7-9
第二部分9-12
中文摘要(二）9-10
Abstract (2)10-12
第三部分12-15
中文摘要（三）12-13
Abstract (3)13-15
第四部分15-19
中文摘要（四）15-17
Abstract (4)17-19
英文缩写词表19-22
第一部分22-64
1 引言22-27
2 材料与策略27-55
2.1 材料27-34
2.2 策略34-55
3 结果55-61
3.1 溶血素基因信号肽浅析55-56
3.2 溶血素基因扩增结果56
3.3 溶血素基因T-A克隆鉴定结果56
3.4 溶血素基因亚克隆酶切结果56-57
3.5 溶血素基因重组蛋白表达和纯化结果57
3.6 抗血清检测结果57-58
3.7 重组溶血素蛋白的溶血效果58
3.8 溶血素基因RT-PCR结果58-59
3.9 钩体溶血素蛋白分泌性检测结果59-61
4 讨论61-63
5 小结63-64
第二部分64-92
1 引言64-67
2 材料与策略67-80
2.1 材料67-68
2.2 策略68-80
3 结果80-88
3.1 细胞因子芯片结果80
3.2 CCK-8检测THP-1和J774A.1细胞活性的结果80-82
3.3 重组溶血素蛋白推动人和小鼠巨噬细胞促炎作用82-83
3.4 TLR受体阻断结果83-86
3.5 胞内信号通路阻断结果86-88
4 讨论88-91
5 小结91-92
第三部分92-103
1 引言92-93
2 材料与策略93-96
2.1. 材料93
2.2 策略93-96
3 结果96-100
3.1 问号钩体赖株全菌抗血清及其IgG的MAT效价96
3.2 问号钩体在不同细胞内的状态96
3.3 MDC抑制细胞内吞问号钩体的效果96-97
3.4 PAO抑制细胞内吞问号钩体的效果97-98
3.5 网格蛋白抗体阻断细胞内吞问号钩体的效果98-100
4 讨论100-102
5 小结102-103
第四部分103-115
1 引言103-106
2 材料与策略106-109
2.1 材料106-107
2.2 策略107-109
3 结果109-112
3.1 问号钩体赖株全菌抗血清及其IgG的MAT效价109
3.2 钩体感染THP-1细胞后吞噬泡演变历程109
3.3 问号钩体感染J774A.1细胞后吞噬泡演变历程109-110
3.4 钩体溶血素在THP-1细胞中与不同时期吞噬泡膜分子标志共定位110
3.5 钩体溶血素在J774A.1细胞中与不同时期吞噬泡膜分子标志共定位110-112
4. 讨论112-114
5 小结114-115
全文总结115-116
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