本站原创
摘要：登革热是一种由登革病毒(Dengue Virus, DENV)引起的虫媒传染病,通过蚊子(以埃及伊蚊和白纹伊蚊为主)的叮咬在人群中传播。人类感染DENV后将产生以轻到重的很大范围的临床症候群。尽管绝大多登革热患者显示为种类似流感样的自限性疾病,如登革热(Dengue Fever, DF),然而患者的病情有可能进展到重症登革热,如登革出血热(Dengue Hemorrhage Fever, DHF)或登革休克综合征(Dengue Shock Syndrome, DSS)。在未能得到及时、有效治疗的情况下,重症登革热将对患者的生命造成巨大的威胁。目前,登革热被认为是世界上最为关注的公共卫生不足,其理由主要在于该病的发病率高,流行范围广,并且缺乏行之有效的防治策略。近50年来,尽管全世界在登革热的防治方面做了很多的努力,但是登革热的发病率还是呈现出急剧上升的走势,给流行国家的卫生防控系统以及患者的家庭带来了沉重的经济负担。DENV属于黄病毒科,黄病毒属,是一种有包膜的单股正链的RNA病毒,基因组大约11kb长,包含一个开放性的阅读框,编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。三种结构蛋白分别是衣壳蛋白(capsid protein, C),膜蛋白(membrane protein, M)和包膜蛋白(envelope protein, E)。7种非结构蛋白依次为NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5。根据不同的E蛋白基因序列,DENV可被划分为四种血清型,DENV-1～-4。各种DENV的血清型之间有着60-70%的同源序列。DENV的初次感染可以产生针对感染血清型的终生免疫保护反应,但对其它三型DENV仅有短暂而微弱的交叉免疫保护作用。当二次感染的血清型不同于初次感染的血清型时,患者体内有着的非中和交叉反应性抗体或亚中和浓度的中和抗体可推动DENV进入Fc受体容受细胞,增加病毒的复制,容易导致严重的DHF/DSS的发生。迄今为止,登革热的防治仍缺乏有效的疫苗和抗病毒治疗策略,由此登革热的防治在很大程度上依赖于对登革热进行早期、快速、精确的诊断。目前登革热的诊断有三个金标准,登革热病毒的分离与鉴定、RT-PCR以及血清学诊断。尽管这三种策略在登革热的诊断中发挥着不可替代的作用,但是每种策略都有着自身的缺陷,例如登革热病毒分离和鉴定需要的时间长,检测阴性率高,对实验室和实验技术人员的要求高；RT-PCR不仅对实验室环境、实验设备和实验人员的要求高,而且设备昂贵,难以推广；另外,登革热感染后,患者往往需要一定的时间才能出现抗体反应,而且登革热与黄病毒的抗体之间有着广泛的交叉,由此血清学策略虽然简便、经济,但是不能进行早期诊断,而且可能因为有着黄病毒之间的交叉反应而出现检测阳性的结果。由此,建立一种简单、方便、早期、快速、精确、经济的诊断策略仍是登革热探讨中亟待解决的不足。NS1蛋白是DENV中一种保守的糖蛋白,在感染的早期即可在血清中检测到高浓度的有着,并与登革热疾病的严重程度密切相关。近10余年来,各种形式的以NS1抗原捕获为基础的免疫浅析法得以建立并商品化。这些NS1抗原检测策略都具有早期、快速、特异、价廉、易于操作等特点。通过对NS1抗体的精心选择而建立的血清学特异性的NS1抗原抗捕获ELISA甚至具有血清分型的作用,由此,以NS1抗原为靶标的免疫浅析法在登革热的诊断中具有重要作用。然而,NS1蛋白在登革热感染的不同时期血清中的分布情况仍不甚明了。对于NS1蛋白动力学的充分揭示有助于浅析NS1抗原检测在登革热诊断中的作用和作用。在本实验室的前期工作中,我们用杂交瘤技术制备了一组抗DENV NS1单抗,用酶联免疫吸附试验(enzyme pnked immunosorbent assay, ELISA)、免疫荧光试验(immunofluorescence assay, IFA)和蛋白印迹实验(western blot, WB)对这些单抗的免疫反应性进行了浅析,在此基础上,通过对这些单抗的优化配对,建立了高度敏感和特异的四种血清型特异性的NS1抗原捕获ELISA,以及一种DENV群特异性的NS1抗原捕获ELISA。在本探讨中,利用DENV-1特异性的NS1抗原捕获ELISA,我们动态浅析了NS1抗原在DENV-1初次感染患者不同发病时期血清中的分布情况,结合DENV IgM和IgG抗体的检测,揭示了抗原抗体的联合检测在登革热诊断中的作用。DENV NS1抗原的检测不仅在登革热的诊断中具有很大的优势,而且,基于NS1抗原检测ELISA还具有DENV病毒滴定的作用。此外,利用NS1抗原检测ELISA,在本探讨中,我们还建立了一种DENV抗体检测的微中和试验。结合商品化的DENV IgM和IgG抗体捕获ELISA,本实验室自制的DENVE蛋白Ⅲ区(EDⅢ) IgG抗体捕获ELISA,我们对来自同一组DENV-1初次感染患者在发病期和3年后的随诊期血清中的中和抗体、DENV IgM和IgG抗体,EDⅢIgG抗体进行了检测和比较,揭示了随时间的变化DENV患者体内抗体水平的动态变化情况,并为登革热的流行病学调查以及登革热疫苗有效性的验证提供了可能更为有效的检测手段。尽管NS1抗原检测的ELISA策略在登革热的诊断中具有很好的敏感性,但这种策略的操作还是略嫌复杂。登革热快速诊断用的胶体金法仍是许多临床医生和探讨者的目标,但现有的NS1捕获的胶体金法仍缺乏足够的敏感性。在前期工作中,我们发现NS1抗原捕获ELISA的检测极限可达1：5120的血清稀释度,提示这种策略中采取的单抗具有很高的亲和力,但这些ELISA策略中利用的高亲和力NS1单抗并不适合胶体金法。为开发高度敏感的登革热快速诊断的胶体金法,需要对NS1单抗亲和力进行详细的浅析。在本探讨中,我们采取了非标记技术,共振波导光栅(Resonant Weguide Grating, RWG)和表面等离激元(Surface Plaon Resonance, SPR),对大量NS1单抗的亲和力进行了筛选,以而为NS1检测的胶体金法提供了详细的抗原抗体相互作用的动力学信息。由此,本探讨分为以下三个方面的内容：第一部分：DENV-1初次感染患者血中NS1抗原和IgM和IgG抗体动态分布浅析登革热NS1抗原检测和血清学浅析是登革热诊断中最为经济、有效的策略,在登革热的诊断中具有非常重要的地位。在本探讨中,我们用自制的DENV-1特异性的NS1抗原捕获ELISA,结合商品化的IgM和IgG抗体捕获ELISA,对广州2006年DENV-1初次感染的确诊患者在发病当天到发病27天的血清标本中的NS1抗原和IgM、IgG抗体在动态分布规律进行了探讨。结果发现,在发病的当天,87.5%的患者血中即可检出阳性的NS1蛋白,在发病的第1到第7天,也就是整个登革热病程的急性期,NS1的阳性检测率在81.8%-91.1%之间的高水平检测率范围内波动。而到了发病的第8到14天,也就是疾病的恢复早期,这种NS1检测的敏感性呈现出显著的下降,到发病的第14天后,也就是疾病的恢复晚期,NS1无法测到。与NS1抗原分布不同,IgM和IgG抗体分别在发病的第3和第5天才开始在血中显现,并出现检出率的逐渐升高。其中IgM抗体较IgG抗体不仅出现更早,而且上升的速度更快,在发病的第8天,IgM的检测达到检测高峰的100%,而IgG抗体则在发病的第15天才达到检测的高峰(100%)。NS1抗原和IgM抗体在血中的分布呈现一种相反的互补规律,当用两者策略进行联合检测时,可大大提升登革热诊断的敏感性、缩短检测的窗口期、延长检测的时限。体现为在两者的检出开始出现交叉的第3天一直到恢复期,联合诊断的阳性率可高达96.6-100%,显著高于单独的NS1抗原或IgM抗体检测的敏感性。探讨表明,登革热NS1抗原和IgM、IgG抗体的联合检测为不同感染时期的初次感染患者提供了个较为理想的登革热诊断案例,这种案例基本上可以满足对登革热进行简单、经济、快速、有效的诊断要求。第二部分：1型登革病毒初次感染患者急性期和康复期血清学动态浅析登革热患者血清中抗体的检测不仅对登革热的诊断,而且在登革热流行病学调查以及疫苗有效性的验证等方面具有重要作用,但登革热感染后,各种抗体随时间的动态变化情况尚未得到充分阐明,而且现有的登革热抗体检测策略仍无法充分满足临床和探讨的需要。在本探讨中,利用DENV NS1抗原捕获ELISA,我们建立了一种DENV中和抗体检测的微中和试验,结合商品化的Panbio IgM和IgG抗体捕获ELISA,以及自制的抗登革热EDⅢ IgG抗体捕获ELISA对DENV-1初次感染患者在发病期以及3年余后随诊期的血清标本进行了DENV相关抗体的检测。探讨发现,登革热特异性的IgM和IgG抗体的检出率随时间的推移而发生下降,但抗EDⅢ IgG抗体的检出率随时间的推移在体内继续保持着稳定的检出率。在随诊期,抗EDⅢ IgG抗体捕获ELISA对血清标本检测的敏感性显著高于Panbio IgG抗体捕获ELISA。这一结果不仅提示了EDⅢIgG ELISA是一种更为敏感的抗体检测策略,而且EDⅢ IgG抗体在体内的稳定检出率还提示了EDⅢ蛋白在登革热的免疫发病机制中可能有着重要作用。而微中和实验显示,发病期血清的中和抗体在四型DENV中具有很强的交叉中和活性,但随时间的推移,异型中和抗体滴度出现下降,或者是持续维持着一个低水平,而同型中和抗体则随时间推移出现滴度的上升,到随诊期,血清中同型中和抗体成为了最具优势的中和抗体。但本探讨未能显示EDⅢ IgG抗体与中和抗体之间有着统计学上的相关性。本探讨不仅揭示了登革热感染后,各种抗体随时间的变化而发生动态变化的规律,而且表明,本探讨室自制的抗登革热EDⅢIgG抗体捕获ELISA,以及基于NS1抗原ELISA的微中和实验可能是登革热诊断和流行病学调查的有效的检测工具,尽管其有效性仍需要通过对更大样本的进一步检测而得证实。第三部分：共振波导光栅和表面等离激元技术对登革热NS1单抗与NS1蛋白亲和力的鉴定与比较尽管我们建立的DENV NS1ELISA具有较好的敏感性和特异性,但是这些NS1ELISA中所采取的抗体并不适用于胶体金法。基于DENV NS1抗原检测的胶体金法是一种DENV的快速诊断策略,可以作为床边诊断(bedside diagnosis)以及现场、出入境的快速筛查,是DENV诊断的探讨热点。为寻找胶体金法NS1抗原检测法适合的单抗,在本探讨中,我们采取两种免标记(non-labeled)技术,共振波导光栅(Resonant Weguide Grating, RWG)和表面等离激元(Surface Plaon Resonance, SPR)对DENV NS1单抗与NS1蛋白的亲和性进行了进一步的浅析。在前期利用免疫标记技术获得的DENV NS1mAbs的免疫反应性的基础上,我们选出了80株,55株,75株和64株分别针对DENV-1, DENV-2, DENV-3和DENV-4NS1的反应性单抗。先用RWG这种高通量的免标记技术对这些单抗在饱和结合状态下的亲和力进行了初筛。结果显示,这些抗体的亲和力的范围在10nM-1mM之间。随后用SPR对这些抗体与抗原相互作用的动态历程进行了进一步的详细浅析。SPR策略的检测不仅可以提供NS1单抗与NS1蛋白的亲和力,也就是平衡解离常数(equipbrium dissociation constant, KD),而且可以进一步提供两者之间的结合常数(association constant, Ka)及解离常数(dissociation constant, Kd),以及代表NS1单抗对NS1蛋白可及性(accessibipty)的单抗活性百分数。在本探讨中,用SPR得出NS1单抗的亲和力范围位于1nM～100nM之间,这些单抗同时也是RWG策略检测到的高、中亲和力的单抗(KD=10nM-100nM),但绝大部分抗体在SPR中显现为无反应性。SPR检测出的NS1单抗的K。和则分别波动在103到105Ms-1之间和10-7到10-2S-1之间。而DENV-1, DENV-2, DENV-3和DENV-4NS1反应性的单抗的活性百分数则分别波动在1.6%-47.2%,2.5%-70.3%,1.0%-26.2%和0.9%-27.2%之间。除DENV-4NS1反应性单抗外,在RWG所测得的高亲和力(KD=1OnM)单抗,其在SPR中测得的活性百分数显著高于RWG测得为中等亲和力(KD=1OOnM)的单抗。探讨表明,免标记的RWG和SPR技术是检测分子之间相互作用的亲和力的有效工具。当对大量标本进行筛查时,可先用高通量的RWG可以对大量的抗体初筛,排除低亲和力和低活性百分数的标本,然后用SPR对高亲和力和高活性百分数的抗体进行进一步动力学浅析。根据SPR的检测结果,一些具有高结合常数的NS1单抗可作为胶体金的NS1抗原检测策略中的检测和捕获抗体,尽管其有效性仍需要得到进一步的验证。小结通过以上三部分的探讨结果发现,本探讨的具有以下三个革新之处,其中包括：一、利用我们建立的DENV-1特异性NS1抗原捕获ELISA和商品化的Panbio IgM和IgG抗体捕获ELISA,观察了DENV-1初次感染确诊患者以发病的第1天到第27天血清中NS1抗原和IgM、IgG抗体水平的动态变化情况。首次揭示了登革初次感染患者DENV NS1抗原和IgM抗体互补的消长规律,提示了NS1抗原检测在急性期以及IgM抗体检测在恢复早期登革热诊断中的作用,而这两种策略的联合检测,不仅可以大大提升登革热诊断的敏感性,而且可以缩短登革热诊断的“窗口期”,延长登革热诊断的时限。二、在本探讨中,通过对同一组患者在发病期和随诊期血清中各种抗体动态浅析发现,登革热特异性的IgM和IgG抗体的检出率随时间的推移发生衰退,而抗EDⅢ IgG抗体随时间的推移依然保持着稳定的检出率,提示自制的DENV EDⅢ IgG抗体捕获ELISA有可能是一种有效的登革热血清流行病学调查的工具。而基于NS1抗原检测的微中和实验对系列血清中的中和抗体检测提示,发病期血清的中和抗体在四型DENV中具有更强的交叉中和活性,但异型中和抗体滴度随时间的推移出现下降,或者是一直维持着一个低水平,而同型中和抗体随时间推移则出现上升,并逐渐显示为优势的抗体中和效价。本探讨不仅揭示了登革热感染后,各种抗体随时间的变化而发生动态变化情况,而且为登革热的诊断和流行病学调查提供了可能较为有效的登革热感染的血清学检测策略。三、为建立登革热进行快速诊断的NS1抗原捕获胶体金法,我们采取了两种检测分子之间相互作用的免标记技术,RWG和SPR对DENV NS1单抗与NS1蛋白的亲和力进行的鉴定与比较。其中,RWG是一种高通量的免标记技术,而SPR可对分子之间相互作用的动力学信息进行详细地浅析。探讨发现,RWG对抗原抗体结合的饱和状态下的亲和力的筛查,不仅可以检测出在SPR中高亲和力的抗体,而且还能检测出高活性百分数的抗体。而SPR的进一步浅析提供了抗体的结合常数和解离常数,其中抗体的结合常数将为胶体金法的NS1抗原检测最佳的抗体候选物的选择提供了详细的信息。两种非标记技术的结合,为大量NS1单抗亲和力的检测提供了一个快速、经济、详细、精确的途径。关键词：登革病毒论文非结构蛋白1论文诊断论文抗体论文共振波导光栅论文表面等离激元论文
摘要3-11
ABSTRACT11-22
前言22-28