摘要：药物及其中间体残留带来的污染不足已经对生态环境安全及人体健康构成威胁。4-氨基安替比林(AAP)作为一种原料或者中间体,大量用于生产镇痛、消炎、抗菌类的新型药物,AAP会引起粒性白血球缺乏症等毒性作用,已经成为一种暴露于环境中的污染物。探讨表明氧化应激与所有的疾病有关,环境污染物对生物体产生的危害与氧化应激密切相关。在氧化应激历程中,活性氧类物质(ROS)在生物体内大量表达,参与并推动多种疾病的发生进展历程,造成DNA/RNA、蛋白质、脂类等生物分子的氧化损伤,以而导致机体代谢紊乱,引发疾病。由此,利用氧化应激这一生物学指标来评价环境污染物的毒性效应,有助于人们了解环境污染物的致病机理,全面评价其毒性,为疾病的早期诊断、预防和治疗提供科学依据。本论文以环境毒理学、现代仪器浅析科学为背景,以实验动物、单细胞、蛋白质分子三个层面探讨4-氨基安替比林的氧化应激效应及其作用机理。本论文主要包括以下五个部分：第一章介绍了AAP的特性和用途,概述了AAP毒性效应的探讨进展；介绍了活性氧物质和抗氧化系统的组成和特点,综述子环境氧化应激的诱发因素；归纳了氧化应激与疾病的相关联系；总结了环境毒理学中氧化应激的评价策略。第二章以斑马鱼作为探讨对象,以实验动物层面进行了急性染毒实验,测定了AAP对斑马鱼的半数致死浓度LC50-24h,对斑马鱼肝脏中抗氧化系统以及氧化损伤程度的影响,评价了AAP的氧化应激效应。结果表明,AAP导致ROS清除直接相关的CAT和GPx酶活性增大,间接对抗ROS的GR和GST酶活性减小,SOD酶活性没有显著变化,GSH含量显著下降,GSSG含量上升,GSH/GSSG比率显著下降,肝脏组织中的氧化还原平衡被打破,诱发了氧化应激。MDA的含量逐渐增大,说明体内氧化应激损伤产物LOP增加,造成了脂肪组织的氧化损伤。第三章以人血红细胞作为探讨对象,对其进行体外染毒,以单细胞水平探讨AAP对人血红细胞中GSH含量的影响,评价其氧化应激效应。结果表明,在低AAP染毒浓度时,虽然GSH含量的平均值没有显著的变化,但是单细胞浅析的结果显示低GSH含量的细胞开始出现。当AAP浓度增大,AAP对GSH含量有显著的影响,低GSH含量的细胞增加,GSH减少可达14.53%。GSH的消耗导致红细胞内环境向氧化型转变。第四章选取血液中的传输蛋白(牛血清白蛋白和牛血红蛋白)为探讨对象,以蛋白质分子水平上探讨AAP与血液中传输蛋白的相互作用。污染物与血液中传输蛋白的结合决定了其在体内的传输和分布。利用多种光谱和分子模拟技术,建立二者间的作用模型,探讨其结合作用机理。1)利用光谱和分子模拟的策略在模拟生理条件下探讨AAP与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的结果表明,AAP与BSA之间属于静态猝灭猝灭,AAP与BSA之间具有较强的相互作用,显正电性的AAP可以通过静电作用自发的跟带BSA分子上带负电的区域相结合,结合在BSA的亚域ⅢA处,导致了BSA微环境和空间构象的转变。2)利用荧光、同步荧光、紫外-可见吸收和圆二色谱技术探讨了AAP和牛血红蛋白(BHb)的结合作用。结果表明,AAP和BHb具有较强的相互作用,并且通过范德华力和氢键以1：1的比例结合,AAP导致BHb微环境发生变化,骨架结构变的松散。第五章选取氧化应激直接相关的三种酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶)作为探讨对象,利用光谱和分子模拟技术,以分子水平上探讨了AAP对抗氧化酶的毒性作用机理。由于谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)昂贵且不易保存,我们选用同类的辣根过氧化物酶(Hrp)来模拟GPx。1)酶活性评定、光谱和分子模拟的探讨结果表明,AAP可以通过氢键和范德华力自发地跟Cu/ZnSOD结合,形成AAP-Cu/ZnSOD结合物,AAP结合在Cu/ZnSOD两个子域的交界面上。AAP诱发了Cu/ZnSOD二级结构发生转变,导致Cu/ZnSOD骨架松散,内部疏水性的多肽链对水的暴露增加,影响了活性位点的微环境,以而对Cu/ZnSOD酶活性产生了抑制作用。2)光谱实验和分子模拟的探讨结果表明,带正电的AAP可以通过静电作用自发的与带负电的过氧化氢酶(CAT)以1：1的比例结合在CAT中心疏水腔内。CAT的微环境和空间结构受到AAP的影响,导致CAT骨架结构松散,以而影响了CAT活性位点的微环境,造成了血红细胞中CAT酶活性的抑制作用。3)利用荧光、紫外-可见、同步荧光和圆二色谱等技术探讨了AAP和辣根过氧化物酶(Hrp)的作用机理,考察了二者的结合参数(结合常数、结合位点数、热力学常数和结合力类型)以及AAP对Hrp空间结构的影响。AAP和Hrp具有较强的相互作用,并且通过静电作用以1：1的比例结合,AAP导致了Hrp微环境、二级结构和构象发生变化,造成Hrp的空间结构松散。动物和分子水平上的探讨结果表明,抗氧化酶活性受到三方面因素的影响,第一,AAP与抗氧化酶二者间直接结合作用会对抗氧化酶活性产生抑制作用；第二,组织发生氧化应激时,抗氧化酶处于ROS大量表达的环境中,直接催化分解ROS的抗氧化酶的酶促反应底物含量增大,这将有刺激抗氧化酶数量增加的走势；第三,AAP急性染毒会对抗氧化酶的含量产生影响。这三个因素影响的相对大小,最终决定了在动物实验中抗氧化酶酶活性的表观变化情况。第六章最后对论文的各探讨部分进行了总结,浅析了本探讨中AAP氧化应激效应评价策略的优势与不足,展望了该领域的进展方向。本探讨以分子、细胞和动物整体实验的角度较系统、全面地提供了AAP诱发机体氧化应激效应的评价结果,丰富了环境污染物诱发氧化应激效应的评价策略,有助于人们以分子水平了解环境污染物的致病机理和全面评价污染物毒性,为相关疾病的早期诊断、预防和治疗提供了参考和判定依据。关键词：4-氨基安替比林论文氧化应激论文斑马鱼论文抗氧化酶论文微流控单细胞浅析论文多种光谱法论文分子模拟论文
摘要10-13
ABSTRACT13-17
符号说明17-18
第一章 绪论18-31
1.1 4-氨基安替比林介绍及其毒性效应18-19
1.1.1 4-氨基安替比林介绍18-19
1.1.2 4-氨基安替比林的毒性效应19
1.2 氧化应激及其诱发因素19-24
1.2.1 氧化应激19-20
1.2.2 活性氧(氮)物质和抗氧化系统20-22
1.2.3 环境氧化应激的诱发因素22-24
1.3 氧化应激损伤与疾病24-27
1.4 环境毒理学中氧化应激的浅析评价27-28
1.5 论文的探讨目的、探讨内容和探讨作用28-31
1.5.1 论文的探讨目的28-29
1.5.2 论文的主要探讨内容29-30
1.5.3 论文的探讨作用30-31
第二章 4-氨基安替比林对斑马鱼肝脏的氧化应激效应探讨31-43
2.1 前言31-32
2.2 实验部分32-34
2.2.1 试剂32
2.2.2 实验仪器32
2.2.3 实验斑马鱼32
2.2.4 测定AAP对斑马鱼的半数致死浓度(LC_(50)-24 h)32-33
2.2.5 急性毒性测试及肝脏组织匀浆液的处理33
2.2.6 抗氧化酶活性的测定33-34
2.2.7 还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量的测定34
2.2.8 脂类过氧化物34
2.2.9 组织匀浆液蛋白质含量测定34
2.2.10 计算与数据浅析34
2.3 结果34-39
2.3.1 急性毒性测试(24 h LC_(50))34-35
2.3.2 不同浓度AAP的暴露35
2.3.3 抗氧化酶35-37
2.3.4 谷胱甘肽非抗氧化酶系统37-39
2.3.5 脂质过氧化物的生物标记物MDA39
2.4 讨论39-42
2.5 结论42-43
第三章 利用微流控和荧光成像技术评价4-氨基安替比林诱发人血红单细胞中谷胱甘肽消耗的氧化应激效应43-53
3.1 前言43-44
3.2 实验部分44-45
3.2.1 试剂44
3.2.2 实验仪器44
3.2.3 细胞的前处理：染毒和衍生44
3.2.4 微流控芯片的制造和修饰44-45
3.2.5 单细胞内GSH的测定45
3.2.6 GSH的标准曲线45
3.3 结果与讨论45-51
3.3.1 测量条件的优化45-48
3.3.2 评价AAP诱发人血红单细胞中GSH含量减少的氧化应激效应48-51
3.4 结论51-53
第四章 4-氨基安替比林与血.液传输蛋白的相互作用53-72
4.1 4-氨基安替比林与牛血清白蛋白相互作用的探讨53-65
4.1.1 前言53
4.1.2 实验部分53-54
4.1.3 结果与讨论54-64
4.1.4 结论64-65
4.2 光谱策略探讨4-氨基安替比林对牛血红蛋白的毒性作用65-72
4.2.1 前言65
4.2.2 实验部分65
4.2.3 结果与讨论65-71
4.2.4 结论71-72
第五章 分子水平评价4-氨基安替比林对氧化应激关键酶的影响72-102
5.1 4-氨基安替比林对抗氧化酶铜-锌超氧化物歧化酶的毒性作用72-84
5.1.1 前言72
5.1.2 实验部分72-74
5.1.3 结果与讨论74-84
5.1.4 结论84
5.2 4-氨基安替比林和过氧化氢酶的分子作用揭示了这种药物的潜在毒性机理84-95
5.2.1 前言84-85
5.2.2 实验部分85-86
5.2.3 结果与讨论86-94
5.2.4 结论94-95
5.3 多种光谱法探讨4-氨基安替比林对辣根过氧化物酶的毒性作用95-102
5.3.1前言95
5.3.2 实验部分95
5.3.3 结果与讨论95-101
5.3.4 结论101-102
第六章 主要结论和探讨展望102-105
6.1 主要结论102-104
6.1.1 4-氨基安替比林对斑马鱼肝脏的氧化应激效应探讨102
6.1.2 利用微流控和荧光成像技术评价4-氨基安替比林诱发人血红单细胞中谷胱甘肽消耗的氧化应激效应102
6.1.3 4-氨基安替比林与传输蛋白的相互作用102-103
6.1.4 分子水平评价4-氨基安替比林对氧化应激关键酶的影响103-104
6.2 论文的革新点104
6.3 论文的不足和探讨展望104-105
附表105-119
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