摘要：β-环糊精葡萄糖基转移酶(p-CGTase)属于α-淀粉酶家族,可以作用于淀粉的葡萄糖基,以而发生环化、耦合、歧化、水解等反应,其中环化作用生成的β-环糊精(β-CD)具有非极性空穴和外亲水的特点,有稳定、增溶、缓释以及掩蔽异味的作用,作为分子胶囊和乳化剂在食品、医药、化妆品、农药、化学工业等领域具有广泛、重要的运用。β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)是催化淀粉发生环化反应生成β-CD的关键酶,近年来,由于酶活性的影响使得酶法生产β-CD的产率非常低,由此,借助基因工程技术手段对β-CGTase进行体外定点改造已成为目前探讨的热点。本论文以实验室前期构建保藏的一株产β-CGTase的重组工程菌pUC-18::CGTase为基础,以高产酶为目标,对β-CGTase基因进行体外定点突变,并对突变菌株的发酵工艺优化以及突变酶酶学特性进行了系统的探讨,为满足工业化发酵生产的需要,还进一步利用5L发酵罐放大试验,为酶法工业化生产β-CD提供论述基础和技术支撑。主要探讨内容如下：1、以pUC-18::CGTase为基础,参照NCBI公布的β-环糊精葡萄糖基转移酶的晶体结构,对其进行生物信息学浅析,对其基因序列中保守区域的四个氨基酸位点Y127,H167,R254和D355进行体外基因定点突变,同时通过设计引物在基因的5’端引入His6-Tag,得到4个突变体p-T::CGTaseY127F、p-T::CGTaseH167C、p-T::CGTaseR254F、p-T::CGTaseD355R,分别将4段带有His6·Tag突变基因整合到原核表达载体pUC-18中,构成重组表达载体pUY127F, pUH167C,pUR254F和pUD355R,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,鉴定筛选阳性克隆,得到的突变菌株分别命名为p-YF、p-HC、p-RF和p-DR。经SDS-PAGE及Western blotting检测表明四个突变菌株都可以表达分子量约为70KDa的带有His6·Tag的融合蛋白,与β-CGTase的论述分子量一致。采取蓝值法测定各突变菌株的酶活力,突变菌株p-YF、p-HC、p-RF和p-DR的β-CGTase活力分别为1224U/mg,1228U/mg,1147U/mg,976U/mg,较出发菌株pUC-18::CGTase的活力621U/mg均有显著提升。2、通过对突变酶反应的最适温度、最适pH、温度和pH稳定范围等基本酶学性质测定,发现突变酶与原酶性质基本一致。酶作用的最适温度60℃、最适pH6.0、且酶在60℃下保温1h,pH5.0～8.0范围内均非常稳定。通过对突变酶动力学参数浅析,发现突变菌株p-HC、p-YF的突变酶Km值最小,达到0015mg/mL;而突变菌株p-RF、p-DR的突变酶Km值为0.017mg/mL,均低于出发菌株(0.019mg/mL),说明突变没有影响到酶的催化反应特点,β-CGTase环化活力的提升是由于突变酶与底物玉米淀粉的亲和力的增强。3、通过单因素摇瓶试验,确定了突变菌株产β-CGTase的最佳碳源是玉米淀粉,产酶最佳氮源是蛋白胨和玉米浆组成的复合氮源,添加金属离子镁和磷酸盐可以显著地推动突变菌株产酶和细胞生长。发酵历程中的初始pH值,温度、接种量以及摇床转速都会直接或间接影响到菌体生长及产酶量。采取Box-Benhnken中心组合试验设计和响应面浅析,对突变菌株产β-CGTase的发酵培养基及发酵条件进行多项式回归模型建立和最优化。通过回归模型可以得到培养基组成对突变菌株产(3-CGTase活力影响的大小为玉米淀粉(X1)玉米浆+蛋白胨(X2)MgSO4·7H2O (X3)K2HPO4·3H2O (X4);发酵条件对突变菌株产β-CGTase活力影响的大小为发酵温度(X2)初始pH(X1)转速(X4)接种量(X3)。在此基础上确定了各突变菌株的最优的培养基组成及最优发酵条件。经优化,当突变菌株p-YF的发酵培养基为(%,W/V)：玉米淀粉1.1,玉米浆4.6,蛋白胨1.1,MgSO4·7H2O0.02, K2HPO4·3H2O0.12；在初始pH=8.7,发酵温度37℃,接种量5.3%,转速201r/min下进行摇瓶发酵培养,测得突变菌株p-YF酶活为4235U/mL,是初始酶活的1.99倍；当突变菌株p-HC的发酵培养基为(%,W/V)：玉米淀粉1.1,玉米浆4.4,蛋白胨1.1,MgSO4·7H2O0.02, K2HPO4·3H2O0.10；在初始pH=8.4,发酵温度37.4℃,接种量5.0%,转速202r/min下进行摇瓶发酵培养,测得酶活为4355U/mL,是初始酶活的1.93倍；当突变菌株p-RF的发酵培养基为(%,W/V)：玉米淀粉1.0,玉米浆4.3,蛋白胨1.1,MgSO4·7H2O0.02, K2HPO4·3H2O0.10;在初始pH=8.6,发酵温度37.3℃,接种量5.3%,转速202r/min下进行摇瓶发酵培养酶活为3935U/mL,是初始酶活的1.98倍；当突变菌株p-DR的发酵培养基为(%,W/V)：玉米淀粉1.2,玉米浆4.4,蛋白胨1.1,MgSO4·7H2O0.02, K2HPO4·3H2O0.1;在初始pH=8.4,发酵温度37.6℃,接种量5.0%,转速201r/min下进行摇瓶发酵培养,测得酶活为3640U/mL,是初始酶活的2.19倍。4、在5L发酵罐放大实验中探讨了不同搅拌转速及不同相对溶氧条件、不同温度恒定pH下突变菌株YF发酵产β-CGTase活力的影响。探讨结果表明,当以1.0mol/L的NaOH或0.2mol/LHCl流加调节发酵罐的pH使其保持在8.7不变条件下,搅拌速度提升至300r/min,溶氧制约在20%,温度制约在37℃时,同时以50g/L流加玉米淀粉,20g/L流加玉米浆,50g/L流加乳糖,此时菌体浓度及β-CGTase活力均有所提升,相对酶活2536U/mg,较出发菌株pUC-18::CGTase活力621U/mg提升了4.08倍。将发酵产β-CGTase作用于底物淀粉,采取Hplc-MS对β-CGTase其产物进行浅析,以HPLC-MS图谱可看出,产物分子量为1134.4,与β-CD标准物质的分子量相符,说明β-CGTase对底物淀粉具有环化作用生成β-CD。关键词：β-环糊精葡基转移酶论文定点突变论文原核表达论文发酵论文响应面论文
摘要4-6
ABSTRACT6-12
符号与缩略语说明12-13
第一章 文献综述13-29
1 环糊精的介绍13-16
1.1 环糊精的结构13-14
1.2 环糊精的性质14
1.3 环糊精的运用14-15
1.4 环糊精的生产15-16
2 酶的体外进化及定点突变技术16-21
2.1 酶的体外进化论述依据16-17
2.2 定点突变17-21
3 环糊精葡萄糖基转移酶探讨进展21-28
3.1 环糊精葡萄糖基转移酶介绍21-22
3.2 环糊精葡萄糖基转移酶的来源22-23
3.3 环糊精葡萄糖基转移酶的结构特点23-24
3.4 环糊精葡萄糖基转移酶酶学性质24-26
3.5 环糊精葡萄糖基转移酶的发酵生产方式26-27
3.6 环糊精葡萄糖基转移酶体外定点突变探讨进展27-28
4 本论文主要探讨内容28-29
第二章 β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)基因的定点突变29-45
1 引言29
2 材料和策略29-36
2.1 主要仪器29-30
2.2 酶与试剂30
2.3 质粒与菌株30-31
2.4 培养基及抗生素31
2.5 策略31-36
3 结果与浅析36-39
3.1 突变基因的获得36-37
3.2 重组质粒的双酶切鉴定37-38
3.3 重组质粒的PCR鉴定38
3.4 突变体测序结果浅析38-39
4 讨论39-44
5 小结44-45
第三章 β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)突变基因的表达及其酶学性质浅析45-63
1 前言45
2 材料与策略45-53
2.1 主要仪器45
2.2 酶与试剂45
2.3 质粒与菌株45-46
2.4 培养基及抗生素46
2.5 溶液配制46-48
2.6 策略48-53
3 结果与讨论53-61
3.1 β-CGTase重组突变表达载体的构建53-54
3.2 突变基因测序浅析结果54-56
3.3 突变蛋白的诱导表达及Western blotting鉴定56-57
3.4 突变酶的酶活浅析57
3.5 突变酶的性质57-60
3.6 β-环糊精葡萄糖基转移酶及突变酶的动力学参数60-61
4 讨论61
5 小结61-63
第四章 产β-CGTase重组大肠杆菌发酵工艺优化63-105
1 前言63
2 材料与策略63-66
2.1 主要仪器63
2.2 主要试剂63
2.3 菌株63
2.4 培养基及抗生素63-64
2.5 溶液配制64
2.6 策略64-66
3 结果与浅析66-103
3.1 不同碳源对β-CGTase活力的影响66
3.2 不同氮源对β-CGTase活力的影响66-67
3.3 不同金属离子对β-CGTase活力的影响67-68
3.4 不同磷酸盐对β-CGTase活力的影响68
3.5 初始pH值的确定68-69
3.6 最适发酵温度的确定69-70
3.7 最适接种量的确定70
3.8 最适摇床转速的确定70-71
3.9 响应面法优化突变菌株发酵工艺参数71-103
4 讨论103
5 小结103-105
第五章 5.0L自动发酵罐扩大培养的初步探讨105-115
1 前言105
2 材料与策略105-107
2.1 材料105-106
2.2 策略106-107
3 结果与浅析107-113
3.1 溶氧对β-CGTase发酵历程的影响108-110
3.2 温度对β-CGTase发酵历程的影响110-112
3.4 Hplc-MS检测结果112-113
4 讨论113
5 小结113-115
结论115-117
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