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试议糖苷酶产β葡萄糖苷酶菌株诱变选育与酶分离纯化

收藏本文 2024-04-06 点赞:35543 浏览:160826 作者:网友投稿原创标记本站原创

摘要:p-葡萄糖苷酶通过水解末端非还原性p-D-糖苷键,释放出p-D-葡萄糖和其相应的配基,在自然界中有着广泛。不同来源的p-葡萄糖苷酶在生物能源、食品工业、保健品、农业和其它领域有着广阔的运用前景。尤其作为纤维素酶系中的关键组分,p-葡萄糖苷酶在纤维素降解历程中起着重要的作用。但是目前纤维素酶生产菌株所产β-葡萄糖苷酶含量普遍较低,由此培育高产p-葡萄糖苷酶的菌株具有重要的作用。本探讨选用实验室保藏的一株草酸青霉菌C2’作为出发菌株,主要取得以下探讨成果:通过对原始菌株C2'进行硫酸二乙酯和紫外线-氯化锂复合诱变,运用刚果红平板筛选出诱变菌株草酸青霉菌90182,其发酵5d产β-葡萄糖苷酶酶活为0.69IU/mL,是出发菌株的2.16倍。菌株90182液体发酵培养8d发酵液中p-葡萄糖苷酶酶活最高可达1.14IU/mL;采取单因素法对诱变菌株90182发酵历程中的最适碳源、氮源、无机盐、表面活性剂和初始pH进行了试验;结合中心组合实验设计和响应面浅析策略,得到培养基中影响p-葡萄糖苷酶产量两个显著因素麸皮和硫酸铵的含量分别为41.40g/L和3.11g/L,并通过模型预测产p-葡萄糖苷酶酶活最大值为1.74IU/mL;最终优化后的产p-葡萄糖苷酶液体发酵培养基组成为:麸皮41.40g/L,(NH4)2SO43.11g/L,KH2PO42.0g/L,MgSO4·7H2O0.40g/L, FeSO4·7H2O0.40g/L,吐温-801.0%;经过验证,突变株90182最终产β-葡萄糖苷酶酶活为1.71IU/mL,与响应面法优化前的p-葡萄糖苷酶活1.14IU/mL比较提升了50.0%,并接近于模型预测值。采取乙醇分级沉淀和HiTrap SP XL强阴离子交换层析对发酵粗酶液中的β-葡萄糖苷酶进行了分离纯化,纯化后的比活力比粗酶液提升了9.89倍,p-葡萄糖苷酶的回收率为11.89%,最终经SDS-PAGE验证分离纯化后的β-葡萄糖苷酶组分达到了电泳纯,经双向电泳分离得到分子量大小与SDS-PAGE电泳结果较为一致且具有较高表达量的目标蛋白质点。酶学浅析结果表明诱变菌株草酸青霉菌90182所产β-葡萄糖苷酶最适反应温度为60℃,在40~60℃保温处理120min后均具有良好的热稳定性;最适反应pH值为5.0,在pH3.0-6.0的酸性条件下处理24hrs仍具有较高的酶活性;Mn2+和Fe2+对β-葡萄糖苷酶活力具有较显著的推动作用,Mg2+、Ca2+、K+和Cu2+对β-葡萄糖苷酶具有抑制作用;金属螯合剂EDTA的添加能够显著增强p-葡萄糖苷酶活性。关键词:草酸青霉菌论文β-葡萄糖苷酶论文诱变选育论文分离纯化论文酶学性质论文

    摘要4-5

    Abstract5-10

    引言10-11

    1 β-葡萄糖苷酶的探讨进展11-21

    1.1 β-葡萄糖苷酶的来源及分类11-13

    1.1.1 β-葡萄糖苷酶的来源11-12

    1.1.2 β-葡萄糖苷酶的分类12-13

    1.2 β-葡萄糖苷酶的理化性质13-14

    1.2.1 β-葡萄糖苷酶的相对分子质量13

    1.2.2 β-葡萄糖苷酶的最适pH及pH稳定性13

    1.2.3 β-葡萄糖苷酶的最适温度及温度稳定性13-14

    1.2.4 β-葡萄糖苷酶的底物特异性14

    1.3 β-葡萄糖苷酶的酶活测定策略14-15

    1.4 β-葡萄糖苷酶的分离纯化15-17

    1.4.1 沉淀法15

    1.4.2 层析法15-16

    1.4.3 电泳技术16-17

    1.5 β-葡萄糖苷酶的运用17-19

    1.5.1 β-葡萄糖苷酶在生物能源领域的运用17-18

    1.5.2 β-葡萄糖苷酶在食品工业领域的运用18

    1.5.3 β-葡萄糖苷酶在保健品领域的运用18-19

    1.5.4 β-葡萄糖苷酶在农业领域的运用19

    1.5.5 β-葡萄糖苷酶在其他领域的运用19

    1.6 本论文探讨的目的及作用19-21

    2 高产β-葡萄糖苷酶草酸青霉菌的诱变筛选21-30

    2.1 实验材料21-23

    2.1.1 实验材料21

    2.1.2 主要试剂21-22

    2.1.3 主要仪器22

    2.1.4 溶液及培养基的配制22-23

    2.2 实验策略23-24

    2.2.1 复合诱变及筛选策略23

    2.2.2 液体发酵培养23

    2.2.3 β-葡萄糖苷酶酶活测定23-24

    2.2.4 诱变菌株901B2产酶遗传稳定性的验证策略24

    2.3 实验结果24-28

    2.3.1 高产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选24-26

    2.3.2 诱变菌株产β-葡萄糖苷酶活性测定26-28

    2.3.3 诱变菌株901B2产酶的遗传稳定性28

    2.4 讨论28-29

    2.5 本章小结29-30

    3 诱变菌株901B2产酶条件的优化30-41

    3.1 实验材料30-31

    3.1.1 实验材料30

    3.1.2 主要试剂30-31

    3.1.3 主要仪器31

    3.1.4 溶液及培养基配制31

    3.2 实验策略31-32

    3.2.1 诱变菌株901B2发酵产酶曲线的绘制31-32

    3.2.2 菌株产酶发酵条件的单因素法优化策略32

    3.2.3 菌株产酶发酵培养基的响应面法优化设计32

    3.3 实验结果32-39

    3.3.1 901B2的发酵产酶历程浅析32-33

    3.3.2 高产β-葡萄糖苷酶的单因素条件优化33-36

    3.3.3 高产β-葡萄糖苷酶的响应面优化结果36-39

    3.4 讨论39-40

    3.5 本章小结40-41

    4 β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质探讨41-59

    4.1 实验材料41-43

    4.1.1 实验材料41

    4.1.2 主要试剂41-42

    4.1.3 主要仪器42

    4.1.4 溶液及培养基配制42-43

    4.2 实验策略43-47

    4.2.1 发酵粗酶液的制备43

    4.2.2 蛋白质含量的测定43-44

    4.2.3 β-葡萄糖苷酶的分离纯化44-45

    4.2.4 β-葡萄糖苷酶的双向电泳浅析45-46

    4.2.5 β-葡萄糖苷酶酶学性质的测定策略46-47

    4.3 实验结果47-56

    4.3.1 蛋白质含量标准曲线47

    4.3.2 β-葡萄糖苷酶分离纯化结果47-51

    4.3.3 β-葡萄糖苷酶双向电泳浅析51-52

    4.3.4 β-葡萄糖苷酶酶学性质探讨52-56

    4.4 讨论56-58

    4.5 本章小结58-59

    结论59-60

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