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摘要：血管内皮功能的转变在动脉粥样硬化形态学转变之前，就参与了损伤的进展及随后的临床并发症，与高血压等心血管疾病联系密切。内皮功能受损时，血管舒张因子分泌减少，血管收缩因子分泌增加，这推动了血管平滑肌细胞的增殖，导致血管壁增厚和血管结构重塑，动脉弹性下降，外周阻力升高，推动高血压及其并发症的发生进展。另外，高血压引起的血流切应力和内分泌环境的变化也可引起内皮功能受损。由此逆转高血压内皮功能不建全不仅是降压之外的新靶点，同时也是阻止动脉粥样硬化发生进展的重要环节，内皮功能不建全检测就更强调无创、易操作及快捷。指尖脉搏容积测定（Pulse ampptude volume，P）是随着指尖检测内皮功能的迅猛进展而新近出现的检测手段，但尚无相关的临床运用的报道。氨氯地平（Amlodlpine）作为第三代钙通道阻滞剂，是临床运用最为广泛的降压药物之一。氨氯地平是由左旋氨氯地平（S(-)-amlodipine）和右旋氨氯地平（R(-)-amlodipine）以1：1的比例构成的外消旋混合物，其降压作用主要来自左旋体，其效用是右旋体的1000倍。但除了降压本身的血管功能保护作用外，因为右旋体的有着是否使氨氯地平与左旋氨氯地平相比具有额外的内皮功能保护作用尚不清楚。本探讨通过检测这两种药物治疗前后高血压患者血管内皮功能的变化，探讨两者在取得相同降压效果的情况下是否具有相同的内皮保护作用，同时探讨P与FMD检测高血压内皮功能的相关性及一致性；并进一步通过两种药物干预体外培养的人脐静脉内皮细胞，探讨两者影响NO的水平及其机制。策略：1临床试验采取随机、交叉设计，选择原发性高血压病病人24例，随机分为A组及B组，A组服用苯磺酸氨氯地平（辉瑞制药）5mg1/日，B组服用苯磺酸左旋氨氯地平（施慧达药业）2.5mg1/日，均为晨起服药，治疗6周后经过2周清洗期，待患者血压及心率恢复到第一次清洗期水平后再将两药交叉继续用药6周。在基线期和每个治疗期结束时，受试者会接受采血以及血管功能检测，检测前8小时禁食并禁止吸烟、饮酒及咖啡。检测项目包括：全自动动脉硬化检测仪（欧姆龙科林VP1000）检测脉搏传导速度(Pulse we velocity,PWV)及踝臂指数(Ankle-branchial index,ABI)；内皮功能诊断仪（SY2000，吉林圣晔尔科技有限公司）检测指尖脉搏容积（P）；彩色超声诊断仪（PHLIP IE33型，美国）检测肱动脉血流介导的血管扩张功能(Flow mediated dilation,FMD)；化学法检测一氧化氮（Nitric oxide,NO）；酶联免疫吸附剂测定（Enzyme pnked immunosorbent assay,Epsa）法检测血清内皮型一氧化氮合酶（Endothepal nitric oxide synthase,eNOS）、内皮素（Endothepn,ET）及血管性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF）。2、体外细胞培养实验体外培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbipcal Vein EndothepalCells,HUVEC)，进行以下检测：2.1化学法检测在eNOS抑制剂Nw-nitro-L-arginine (L-NA)有着或缺失时，氨氯地平及左旋氨氯地平作用25分钟对内皮细胞NO水平的影响。2.2化学法检测在0、5、15及25分钟四个时间点，经氨氯地平、左旋氨氯地平或蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）抑制剂Ro31-8220处理后内皮细胞产生NO的水平。2.3蛋白质印迹法(Wsetern blot,WB)检测在0、5、15及25分钟四个时间点，经氨氯地平或左旋氨氯地平处理后内皮细胞eNOS在Ser1177、Thr495及PKC磷酸化的程度。2.4Wsetern blot法检测在0、5、15及25分钟四个时间点，经PKC抑制剂Ro31-8220处理后内皮细胞eNOS在Ser1177及Thr495磷酸化的程度。结果：1临床试验结果：1.1经氨氯地平及左旋氨氯地平治疗后，与基线期相比患者收缩压、舒张压及心率均有显著下降，且均有显著的统计学差别（P0.01）；但两种药物相比，收缩压、舒张压及心率数值接近，且无统计学差别（P0.05）1.2与基线期相比，两种药物治疗后P、FMD及ABI均有显著增加，均达到统计学差别（P0.05）；PWV均有显著下降，均达到统计学差别（P0.01）；NMD数值变化不大，亦无统计学差别（P0.05）；氨氯地平治疗后与左旋氨氯地平治疗后相比，P、FMD、PWV及ABI测值均稍高，但均未达到统计学差别（P0.05）；其中在FMD上两者相比有接近统计学差别的走势（P=0.053）。1.3与基线期相比，两种药物治疗后NO及eNOS均有显著增加，均达到统计学差别（P0.01）；ET-1及vWF均有显著下降，均达到统计学差别（P0.01）；氨氯地平治疗后与左旋氨氯地平治疗后相比，NO及eNOS水平均稍高，ET-1及vWF水平均稍低，但均未达到统计学差别（P0.05），其中在NO上两者相比有接近统计学差别的走势（P=0.064）。1.4在基线期、氨氯地平治疗后及左旋氨氯地平治疗后这三个节点，P与FMD测值均有显著的相关性（P0.01），氨氯地平治疗后与基线期P测值的差值ΔP（0.24±0.16、0.18±0.15）及左旋氨氯地平后与基线期FMD测值的差值ΔFMD（2.3±1.7%、1.6±1.2%）亦具有显著的相关性（P0.01）。对P及FMD诊断高血压内皮功能不建全进行一致性检验，结果示Kappa=0.647，P0.001，有统计学作用。2体外细胞培养实验结果：2.1在eNOS抑制剂Nw-nitro-L-arginine (L-NA,300mmol/l)有着时，氨氯地平及左旋氨氯地平处理25分钟后NO测值与L-NA组相比数值接近，且均无统计学差别（P0.05）；两种药物之间测值相近，亦无统计学差别（P0.05）。在L-NA缺失时，氨氯地平及左旋氨氯地平处理25分钟后NO测值与对照组相比均有显著升高，有统计学差别（P0.01），氨氯地平组NO测值高于左旋氨氯地平组，有统计学差别（P0.05）。2.2经氨氯地平（1μmol/l）处理5、15及25分钟后NO水平逐渐增加，在25分钟达到最高值，15及25分钟时NO水平与对照组相比均有显著升高，且均达到统计学差别（P0.01）；经左旋氨氯地平（1μmol/l）处理5、15及25分钟后NO测值均增加，在15分钟达到最高值，5、15及25分钟时NO水平与对照组相比均达到的统计学差别（P0.01）；氨氯地平组与左旋氨氯地平组相比，除5分钟外，15及25分钟时NO水平均是前者较高，其中25分钟时两者达到统计学差别（P0.05）。内皮细胞经PKC途径抑制剂Ro31-8220（30nmol/l）处理5、15及25分钟后NO测值也逐渐增加，在25分钟达到最高值，15及25分钟时NO测值与对照组相比均有显著的统计学差别（P0.01）。2.3氨氯地平对内皮细胞的刺激引起eNOS在Ser1177磷酸化和Thr495去磷酸化的增加，并且作用在5、15及25分钟逐渐加强，在25分钟达到峰值；左旋氨氯地平对eNOS在Ser1177磷酸化和Thr495去磷酸化作用不大，在5、15及25分钟这三个时间点未体现出显著的走势。2.4氨氯地平可以使PKC本身磷酸化减弱，并且作用在5、15及25分钟逐渐加强，在25分钟达到峰值；左旋氨氯地平对PKC去磷酸化作用不大，在5、15及25分钟这三个时间点未体现出显著的走势2.5PKC抑制剂Ro31-8220对内皮细胞的刺激引起eNOS在Ser1177磷酸化和Thr495去磷酸化的增加，并且作用在5、15及25分钟逐渐加强，在25分钟达到峰值。结果小结：1、在检测治疗前后高血压患者内皮功能改善上，P与FMD具有显著的相关性；在诊断高血压患者内皮功能不建全上，P与FMD具有较好的一致性。2、在取得相似的降压效果时，氨氯地平及左旋氨氯地平均具有良好的内皮保护作用，虽然两药治疗后各项指标相比均无统计学差别，但前者似乎有更好内皮保护作用的走势。3、在体外培养细胞中，氨氯地平及左旋氨氯地平均可以时间依赖性的提升NO水平，左旋氨氯地平组达到峰值较早，但氨氯地平组峰值水平较高。4、氨氯地平可通过PKC途径对eNOS在Ser1177及Thr495磷酸化产生影响有以而使eNOS活化，而左旋氨氯地平对PKC影响不大，也不能对eNOS在Ser1177及Thr495的磷酸化程度产生影响。结论：1、氨氯地平及左旋氨氯地平都通过增加NO水平发挥良好的内皮保护作用，但程度和途径不同。2、P与FMD具有较好的相关性及一致性，可替代FMD进行内皮功能检测。关键词：高血压论文内皮功能论文氨氯地平论文左旋氨氯地平论文
中文摘要4-8
Abstract8-17
第1章 综述17-37
综述 1 高血压与内皮功能17-29
1 内皮功能17-19
2 高血压与内皮功能不建全19-21
3 高血压内皮功能的检测21-28
4 结语28-29
综述 2 氨氯地平与左旋氨氯地平29-37
1 降压作用及不良反应29-31
2 靶器官保护作用31-33
3 对代谢的影响33
4 改善血管内皮功能33-34
5 结语34-37
第2章 实验探讨37-61
前言37-39
第1节 高血压患者治疗前后内皮功能变化的探讨39-48
1 病例39-40
2 策略40-42
3 结果42-45
4 讨论45-47
5 结论47-48
第2节 氨氯地平及左旋氨氯地平对 HUVEC 中 NO 水平的影响及机制48-61
1 材料和仪器48-50
2 实验策略50-55
3 结果55-58
4 讨论58-60
5 结论60-61