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摘要：血吸虫病是一种严重危害我国人民健康、影响畜牧业发展的重大传染性共患病。江湖洲滩既是血吸虫易感地区又是良好的天然牧场,牛放牧在洲滩上反复感染血吸虫已主要的传染源。本实验室研制出了氯硝柳胺牛血吸虫病防护剂(国家发明专利:200610098192.X),并了现场试验,间隔15或30 d喷药一次,牛血吸虫感染率下降90%。该防护剂具有使用方便、价廉、防护时间长、防护效果好的特点,较适合牛血吸虫病防治现场的需求。但是氯硝柳胺牛血吸虫病防护剂(以下称牛防护剂)的防护机制尚不明确。其防护机制的阐明有助于为改良或研制更为的防护剂理论依据,并可拓展血吸虫病防治新途径,改变主要是口服药或皮下植入缓释剂或研制疫苗等手段研究预防血吸虫病的模式且不能取得突破性进展的局面,对血吸虫病的防治具有重大。日本血吸虫尾蚴从皮肤入侵、移行和在体内发育成熟的,牛防护剂皮肤用药后其扩散、透皮吸收、滞留和分布的特点。研究血吸虫入侵至成虫各与药物分布的阶段作用情况,阐明牛防护剂的防护机制。一氯硝柳胺基本性质的研究摇瓶法测定了氯硝柳胺溶解度。氯硝柳胺在pH值为2.0、4.0、5.0、6.8、7.4和8.0缓冲液中的溶解度分别为0.033、0.037、0.078、0.746、0.464和2.518 mg/L;结果氯硝柳胺的溶解度较低,属于水难溶性药物,并具有pH依赖性。水-正辛醇分配体系测定了氯硝柳胺的油/水分配系数,pH值为2.0、4.0、5.0、6.8、7.4和8.0时,其logKapp值分别为3.93、4.26、4.65、4.66、5.20和5.35,氯硝柳胺可以透过皮肤。18 ml立式Franz扩散池,将处理好的鼠皮和牛皮置于扩散池和接收池之间,固定。取牛防护剂500μl,均匀涂布于皮肤表面,接收池加入18ml接收液,排尽气泡,恒温(32±1)°C,匀速搅拌(100 r/min),分别于1、2、4、6、8、10 h接收池中取样,实验中尽可能避光。在取样时更换全部接收液,所取样品用0.45μm滤膜过滤后Hplc测定。鼠皮扩散速率和滞后时间分别为17.17μg/cm2/h和0.97 h;而牛皮中的扩散速率为0.0483μg/cm2/h,并无滞后时间;鼠皮的透皮速率是牛皮的355.5倍。结果氯硝柳胺可以透过鼠皮和牛皮,但透皮速率较慢。氯硝柳胺难溶于水,如制成防护剂喷洒于皮肤表面,一旦牛水中,药物不会溶于水中,具备制成牛防护剂的性质;且该药物可以透过皮肤,但牛皮中的透皮速率远小于鼠皮,可见防护剂用药后,氯硝柳胺既不会溶于水中而流失,也不会血流而代谢,可能会在皮肤上长期滞留。二牛防护剂体外作用牛皮喷洒牛防护剂,阴干后表皮层朝向接收池置于扩散池之间,恒温32°C±0.1、100 r/min匀速搅拌, 6、12、24、36、48、60和72h接收池中取样,实验中尽可能避光,所取样品用0.45μm滤膜过滤后HPLC测定氯硝柳胺浓度。计算牛防护剂体外释放速率为0.0657μg/cm2/h。将氯硝柳胺配制成浓度为0.500、0.100、0.050、0.010、0.005 mg/L的水溶液。每个浓度组取0.3 ml分别置于48孔培养板中,设脱氯水为对照。用接种环加入新逸出尾蚴10-40条/孔,在1、5、10、30和60 min时解剖镜下观察尾蚴在各浓度组药液中的存活情况。氯硝柳胺浓度在0.010 mg/L以下60 min内未见尾蚴死亡;浓度为0.050 mg/L作用时间为5 min时,尾蚴全部死亡;浓度为0.100和0.500 mg/L时1 min内尾蚴全部死亡。氯硝柳胺药物浓度在0.050 mg/L以上时可在较短时间内杀死尾蚴,但浓度在0.010 mg/L以下时,较长时间也不能杀死尾蚴。将长方形玻璃槽(60*20*20 mm)平均分为A、B、C三个区域,注满脱氯水,将新逸出尾蚴用吊环置入槽中,静置1h。槽一侧加入1 mg/L的氯硝柳胺乙醇溶液50μl。在给药后即刻、10、20、30、60、90和120 min观察A、B、C三区中的尾蚴数量。A区在即刻和120 min时尾蚴总数分别为58和59条;B区在即刻和120 min时尾蚴总数分别为62和64条;C区在即刻和120 min尾蚴总数分别为58和59条。结果,尾蚴并无向氯硝柳胺浓度低的方向移动;尾蚴对氯硝柳胺无回避反应。直径40 cm,高50 cm的圆柱形塑料桶注满25°C脱氯自来水,待水静止后,水体表面均匀喷洒1 mg/L氯硝柳胺乙醇溶液。喷洒后不同时间分别在距离水面0、10、20、30、40和50 cm处取水样,HPLC测定氯硝柳胺浓度。结果,药物喷洒与水表面后,1-3 h药物仅停留于水表面。4 h后,10 cm水深处才能检测到一定浓度的药物,23 h后整个水体中药物浓度达到一致,分布均衡。可见药物扩散较慢,但大于皮肤上药物向水体中扩散的速度,皮肤周围水体不能形成局部高浓度区域。以上实验结果:牛防护剂喷洒牛皮肤后,一旦水中,皮肤上的药物可其向水体中扩散,但扩散速率较快。水体中形成的药物浓度不足以杀死周围的尾蚴,也不引起尾蚴的回避。因此,牛防护剂在周围水体中达到防护作用。三牛防护剂皮肤中作用在江西省九江市永修县吴城镇选购5头2-3岁小牛。分别喷牛防护剂500 ml/头,在给药后即刻、1、2、3、5、10、15、20、25和30 d取牛颈下皮肤,装入自封袋,并立刻冰冻保存。回实验室将牛皮尽量剪碎,放入匀浆器中,加入50 ml纯水和10μl乙酸,匀浆30 s后,将匀浆液置于100 ml容量瓶中超声30 min。将超声后的匀浆液冷却至室温,定容。将定容好的液体放入50 ml离心管中4000 rpm离心20 min,取上清经0.45μm滤膜过滤。滤液HPLC测定氯硝柳胺浓度。即刻、1、2、3、5、10、15、20、25和30 d牛皮中平均氯硝柳胺含量分别为17.05、14.72、7.21、4.90、4.92、3.63、3.86、3.63和3.66μg/cm2。可见药物长时间滞留在牛皮肤中,形成高浓度氯硝柳胺的屏障层。30只小鼠随机分为对照组、腹部给药组和背部给药组。待牛防护剂阴干后,腹部贴片法感染小鼠。对照组、腹部给药组和背部给药组的虫荷数分别为30.7±2.5、0和30.5±2.7条。背部给药组与对照组比较,差异无统计学(t=-0.691,P=0.498)。可见在腹部局部用药,在用药后可阻止尾蚴的入侵;而在背部给药腹部感染即在非给药区感染则于对照组差别,不影响尾蚴的入侵。因此,牛防护剂喷洒牛皮肤后,药物在皮肤上滞留,形成高浓度的药物屏障层,并可在短时间内就能杀死尾蚴,足以阻止血吸虫尾蚴的入侵。所以,牛防护剂可能是药物在皮肤中滞留,形成屏障层而防止日本血吸虫的感染。因此,牛防护剂喷洒牛皮肤后,药物在皮肤上滞留,形成高浓度的药物屏障层,并可在短时间内就能杀死尾蚴,足以阻止血吸虫尾蚴的入侵。所以,牛防护剂可能是药物在皮肤上滞留,形成屏障层而防止日本血吸虫的感染。四牛防护剂体内作用从人工感染日本血吸虫的阳性钉螺逸出尾蚴,将上层水倒入10 ml试管中,冰浴10 min,1500 rpm离心3 min,尾蚴沉入管底。倒出试管内液体,加入洗涤液,将尾蚴离心洗涤6-7次。将洗涤好的尾蚴加入培养液,充分吹打液体,计尾蚴密度。并尾蚴密度加入培养液,调整尾蚴密度在100条/ml左右。取0.2 ml含有尾蚴的培养液,放置于96孔细胞培养板中,每孔尾蚴数量为10-30条。将培养板置于37°C、5%CO2培养箱内培育,24 h后观察脱尾数并更换含有氯硝柳胺(浓度为3.000、0.300、0.030、0.003 mg/L)的培养液。每天观察童虫死亡情况。童虫失去半透明外观或不活动时间30 s则判断为死亡。24 h后尾蚴转变为童虫的转化率达90%。在给药后24 h,氯硝柳胺浓度为3.000 mg/L时,童虫死亡率为100%;0.300 mg/L组,给药后24 h时死亡率与对照组死亡率差异无统计学(χ2=2.593,P=0.107),但在48 h与对照组死亡率差异有统计学(χ2=7.725,P=0.005)。0.03 mg/L和0.003 mg/L组死亡率与对照组相比,P值均大于0.05,无统计学。江西省九江市永修县吴城镇选购5头2-3岁小牛。分别喷牛防护剂500 ml/头,在给药后即刻、1、2、6、12、24、48、96、240、360、480、600、720h时取静脉血5 ml,并立即移入肝素管中,4000 rpm离心5 min,分离血浆。血浆中加入4 ml乙腈,4000 rpm离心5 min,上清液过活化好的固相萃取柱,然后用1ml水淋洗小柱。将淋洗好的萃取柱3000 rpm离心3 min,装入自封袋中,回到实验室中洗脱、氮吹、复溶,Hplc测定浓度。即刻、1、2、6、12、24、48、96、240、360、480、600、720 h血中药物平均浓度分别为0.115、0.157、0.193、0.285、0.166、0.129、0.020、0.016、0.013、0.014、0.011、0.008 mg/L。所测得血药浓度数据用PKSolver 2.0药动学软件分析。药物达峰时间为8 h,半衰期为328 h,达峰浓度为0.285 mg/L。结果,牛喷洒牛防护剂后牛血中的药物滞留时间较长,但血药浓度低于0.3 mg/L持续时间也小于24h,并不能杀死童虫。因此,透皮吸收氯硝柳胺杀灭血液中童虫达到防护作用的可能性很小。牛防护剂作用机制研究:牛防护剂喷洒牛皮肤后,药物向水体中扩散,经皮吸收,滞留于皮肤上。但扩散到水体中的药物浓度不足以达到杀死周围的尾蚴,也不引起尾蚴的回避,故体外达到防护效果。喷药后,牛血中的药物滞留时间较长,但血药浓度未达到对童虫杀灭浓度,因此杀灭血液中童虫、成虫达到防护作用的可能性很小。皮肤上可形成高浓度的药物屏障层,且滞留时间长,足以防止血吸虫尾蚴的入侵。因此,牛防护剂可能是药物在皮肤中滞留并形成屏障层的途径,防止日本血吸虫的感染。关键词：日本血吸虫病论文日本血吸虫论文氯硝柳胺论文防护剂论文防护作用论文作用机制论文药代动力学论文
一、摘要5-10
二、Abstract10-17
三、前言17-22
四、正文22-81
（一） 22-40
（二） 40-49
（三） 49-59
（四） 59-77
（五） 全文77-79
（六） 参考文献79-81
五、致谢81-82
六、综述82-96