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摘要：组织蛋白酶D (cathepsin D,缩写CTSD, EC 3.4.23.5)是天冬氨酸蛋白酶家族的成员,属于酸性溶酶体内切酶,广泛存在于脊椎动物、真菌、反转录病毒和一些植物病毒中。CTSD主要是在溶酶体和内吞小体中对机体代谢产生的各种蛋白质以及抗原分解,在脊椎动物免疫中起作用。文昌鱼(amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是现存的与脊椎动物祖先最接近的无脊椎动物,一直被是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。免疫系统的起源和进化是最近研究的热点之一。那么在文昌鱼中,CTSD的功能是什么?有类似脊椎动物的蛋白裂解功能,能否参与无脊椎动物的先天性免疫反应?为了回答上述问题,从青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicus)中克隆具有完整开放阅读框的组织蛋白酶D基因,并对该基因的结构、进化、表达和功能研究。结果,青岛文昌鱼中存在一个全长为1772bp的CTSD cDNA,编码一个395个氨基酸的蛋白质,预测分子量为42.92 kDa。序列分析该蛋白与人的组织蛋白酶D同源性达到57.3%,具有典型的天冬氨酸蛋白酶家族结构,在其N-末端存在45氨基酸序列的前肽(1-45位残基),其中1-16位残基为信号肽,具有一个完整的Asp结构域,有两个Asp (Asp-Thr -Gly)活性中心,上述分析所的基因就是文昌鱼的组织蛋白酶D (AmphiCTSD)。用AmphiCTSD和其它物种CTSD的氨基酸序列构建系统进化树,发现AmphiCTSD与无脊椎动物的组织蛋白酶D聚为一支,提示文昌鱼AmphiCTSD基因较原始。其次,对AmphiCTSD基因在青岛文昌鱼中的表达情况做了研究。成体的实时定量和切片原位杂交实验,AmphiCTSD在文昌鱼的卵、后肠、肝盲囊和皮肤黏膜系统中表达量较丰富,而在精巢中微弱表达。胚胎原位杂交结果文昌鱼AmphiCTSD在其各个发育时期均有表达,尤其在细胞分裂旺盛部位表达较高,很可能与细胞分裂有关。神经胚至两天幼虫之间,AmphiCTSD在肠道部位表达丰度较高。用细菌外毒素(LPS, LTA)处理文昌鱼,AmphiCTSD的表达量分别在经上述外毒素诱导后12h和24h其表达至最低,而后逐渐上升。上述结果,AmphiCTSD很可能与免疫反应。为了在蛋白上验证文昌鱼的AmphiCTSD与免疫,构建AmphiCTSD原核表达载体,转化大肠杆菌后诱导表达。对纯化后的重组蛋白AmphiCTSD复性,复性后的AmphiCTSD在22℃、酸性条件下(pH3.5)可以自我催化去除掉酶原前体而37.8KDa有活性的形式。AmphiCTSD的活性可被组织蛋白酶D特异抑制剂胃酶抑素A抑制,但是不被PM, EDTA,亮肽素和抑肽酶等抑制剂抑制。对底物血红蛋白的酶切活性较低,可以将组蛋白H2A、大肠杆菌和葡萄球菌细胞壁降解,并且AmphiCTSD可以溶解大肠杆菌和金葡萄球菌,暗示AmphiCTSD的酶切活性可能参与了宿主的免疫反应。关键词：文昌鱼论文cathepsin论文D论文克隆论文表达论文组蛋白H_2A论文
摘要5-7
Abstract7-10
章 文献综述10-17
1 前言10
2 组织蛋白酶D的概述10-15
2.1 组织蛋白酶D的发现10-12
2.2 组织蛋白酶D在细胞内的合成、运输及活化12-13
2.3 影响CTSD功能的主要因子13
2.4 组织蛋白酶D的功能及研究进展13-14
2.5 CTSD在食品工业中的应用14-15
3 的研究目的及的技术路线15-17
3.1 研究目的15
3.2 技术路线15-17
章 文昌鱼组织蛋白酶D基因的克隆,鉴定及功能研究17-84
1 前言17
2 与方法17-58
2.1 文昌鱼AmphiCTSD基因全长cDNA序列的克隆17-32
2.2 序列与系统进化分析32-33
2.3 文昌鱼组织蛋白酶D在不同组织中的表达情况33-35
2.4 切片原位杂交35-40
2.5 文昌鱼胚胎组织蛋白酶D基因的整体原位杂交40-44
2.6 重组蛋白pET28a/AmphiCTSD原核表达44-55
2.7 AmphiCTSD的酶活检测及抑制剂对酶活的影响55-57
2.8 文昌鱼AmphiCTSD免疫功能的初步探讨57-58
3 结果58-79
3.1 AmphiCTSD基因cDNA序列的克隆和序列分析58-60
3.2 AmphiCTSD系统进化分析60-64
3.3 AmphiCTSD的表达图式64-68
3.4 重组蛋白的原核表达和纯化68-72
3.5 重组蛋白AmphiCTSD的酶活性分析72-76
3.6 文昌鱼AmphiCTSD的免疫功能76-79
4 讨论与总结79-83
5 展望83-84