摘要：半滑舌鳎是我国沿海特有的重要经济鱼类。由于其雌雄生长差别巨大，雄性个体生长速度过慢加大了养殖成本，严重阻碍了半滑舌鳎养殖产业的规模化推广。由此，解决半滑舌鳎雌雄比例不足，实现全雌化养殖对于半滑舌鳎产业化进展具有重要作用。此外，半滑舌鳎性别决定系统为ZZ/ZW型，具有异型性染色体，并且发现有着天然性逆转现象。由此，半滑舌鳎也是探讨鱼类性别决定和分化的理想模型。本论文围绕半滑舌鳎的性别决定和分化，以大片段基因组文库构建及性别基因筛选、高密度遗传连锁图谱绘制及性别连锁浅析以及性逆转的表观基因组等基因组学探讨的不同层面，初步浅析了半滑舌鳎性别决定和分化的基因组学特点，为半滑舌鳎性别决定机制的剖析奠定了基础。其主要结果如下：1.以pECBAC1为载体，用BamHI和HindIII内切酶构建了2个高质量的半滑舌鳎BAC文库。2个BAC文库共由55,296个克隆组成，空载率小于3.2%，平均插入片段约为156.4kb，两个文库的覆盖率约为半滑舌鳎单倍体基因组大小的13.36倍。根据半滑舌鳎AFLP雌性特异标记和性别相关基因设计Overgo探针，进行同位素原位杂交，获得228个阳性克隆,其中性别相关基因获得阳性克隆76个，平均每个基因阳性克隆为15.2个，和BAC基因组覆盖度基本一致；雌性特异标记获得阳性克隆152个，平均每个标记获得阳性克隆30个，为半滑舌鳎BAC基因组覆盖度2倍多。利用ABI3730常规测序获得含有性别相关基因（Sox9、Dmrt1和Cyp19a1a）和雌性特异标记（CseF382）的5个BAC阳性克隆全长序列，长度分别为127kb（Sox9),145kb (Dmrt1),165kb (Dmrt1),107kb(Cyp19a1a)和135kb (CseF382)。浅析了含有Cyp19a1a基因BAC全长序列的结构特点（重复序列、GC含量、转座元件等），以BAC序列预测了9个基因，其中7个为已知基因。利用青鳉、斑马鱼、三棘刺鱼、红鳍东方鲀和黑青斑河豚的基因组序列开展了Cyp19a1a基因的比较浅析，发现该基因在不同鱼类具有结构和功能的保守性，主要包括所有鱼类的Cyp19a1a基因都具有9个外显子和8个内含子；均含有5个保守的功能域；上游调控元件的保守性以及卵巢高表达的特异性等。2.利用基于新一代测序技术的RAD-Seq构建了半滑舌鳎高密度SNP遗传连锁图谱，并开展了全基因组性别连锁浅析。首先利用HiSeq2000对半滑舌鳎父母本进行了全基因组重测序，获得reads数目分别为113M和101M，测序深度分别达到16.8×和15.1×，基因组覆盖率达到92.8%和94.9%。经过严格的筛选条件，获得父本杂合位点（1:1），母本杂合位点（1:1）以及双亲杂合位点（1:2:1）SNP数目分别为407,084个,397,300个和89,989个,覆盖scaffolds的数目分别为3,553个,3,509个和1,925个,总长度分别为452Mb，453Mb和448Mb,基因组覆盖度达到96.2%,96.4%和95.3%。利用pst1酶切对F1代216个个体进行了RAD-Seq,测序深度为0.4×，reads数目以2,275,870个-11,639,889个，平均为6,224,947个。经过筛选获得RAD-tag数目以699,271个-1,134,343个，平均为913,371个。对F1群体基因分型的结果进行分离比检验（P=0.05），总共得到满足分离比的13,116标记，其中母本杂合的标记为5,610，覆盖scaffolds数目为1,018个，总长为396Mb。父本杂合的标记为6,428，覆盖scaffolds数目为1,031,总长为402Mb。双亲杂合的1:1位点标记为1,078，覆盖scaffolds数目为636个，总长为304Mb。利用Joinmap3.0软件以满足分离比的13,116个标记均匀选取3,528个标记，初步构建了半滑舌鳎高密度SNP遗传连锁图谱，包含22个连锁群，其中常染色体连锁群20个，性染色体连锁群2个。平均每个连锁群含有遗传标记160个,总图距为1999.535cM,平均间距为0.568cM/marker。标记覆盖的scaffolds的总长为422Mb,约占基因组大小的88.4%。利用高密度SNP遗传连锁图谱开展了性别的全基因组连锁浅析，发现其他染色体上的LOD值均在2.5以下，而W染色体上所有的标记LOD值均显著大于2.5，加性效应均为负值，表明W染色体上等位基因与半滑舌鳎性别决定具有显著关联性。3.利用全基因组化测序（WGBS）绘制了半滑舌鳎单碱基分辨率的全基因组化图谱，初步揭示了半滑舌鳎性逆转的表观遗传机制。利用IlluminaHiSeq2000完成了半滑舌鳎正常雌鱼、正常雄鱼和伪雄鱼性腺的WGBS，获得有效数据16.81Gb,21.15Gb和18.63Gb，单链的覆盖深度分别达到19.65×,25.39×和21.60×，mCs约占基因组中所有胞嘧啶的8.67%、8.86%和8.76%。97%以上的化位点都发生在CpG区域，并且绝大多数mCs都具有较高的化水平。半滑舌鳎基因TSS两侧区域具有较低的化水平，而在基因编码区、内含子以及3’UTR区域均具有较高的化水平。所有的转座元件（DNA、LINE、SINE、LTR等）均呈现出与基因组相似的化水平，而简单重复序列（Simple Repeat）和随机重复序列(Tandom Repeat)则呈现出较低的化水平。此外，在各种小RNA区域，则体现出不同的化水平，在snRNA的下游区域具有较高的化水平，在rRNA和tRNA区域化水平相对基因组整体较低，而在miRNA区域则体现出与基因组化类似的水平。根据mCs所在的位置，将半滑舌鳎基因分为化基因和非化基因，在正常雌鱼、正常雄鱼和伪雄鱼中，化的基因为20,237个、20,183个和20,199个，占所有基因的97.03%，96.77%和96.85%，非化的基因仅为619个、673个和657个。伪雄鱼和正常雄鱼基因组化水平整体较为相似，均具有较高的化水平，而与正常雌鱼的差别显著。正常雌鱼和正常雄鱼的DMRs达到了14.87Mb,正常雌鱼和伪雄鱼的DMRs为11.16Mb,而正常雄鱼和伪雄鱼的DMRs仅为0.25Mb。以差别化基因中，筛选到多个与性别相关的基因如Cyp19a1a、 Sox9a、Foxl2、Gsdf等。关键词：半滑舌鳎论文性别决定论文BAC文库论文Cyp19a1a论文SNP图谱论文RAD-Seq论文性逆转论文全基因组化测序论文
摘要5-8
Abstract8-14
第一章 前沿综述14-41
1. 性别决定基因和性别决定机制14-27
1.1 性染色体及性别决定系统15-16
1.2 性别决定基因16-21
1.2.1 哺乳动物性别决定基因（SRY）16-17
1.2.2 鸟类性别决定基因（DMRT1）17-18
1.2.3 两栖动物性别决定基因（DMW）18-19
1.2.4 鱼类性别决定基因（DMY 和 AMHY）19-21
1.3 性别决定基因保守性差别浅析21-24
1.4 重要量别相关基因24-27
1.4.1 Cyp19a1a 基因24-25
1.4.2 Foxl2 基因25
1.4.3 Sox9 基因25-27
1.5 性逆转27
2. 鱼类基因组学探讨27-39
2.1 新一代测序技术28-31
2.2 大片段文库构建-BAC31-33
2.3 利用 RAD-Seq 构建高密度遗传图谱33-35
2.4 表观基因组学-全基因组化探讨35-37
2.5 鱼类全基因组测序37-39
3. 半滑舌鳎是探讨鱼类性别决定的理想模型39-41
第二章 半滑舌鳎 BAC 文库构建及性别相关基因筛选41-55
1. 前言41-42
2. 实验材料和策略42-46
2.1 实验材料42
2.2 实验策略42-46
2.2.1 生理及遗传性别鉴定42-43
2.2.2 流式细胞仪浅析基因组大小43
2.2.3 载体制备43
2.2.4 大片段 DNA 的制备43-44
2.2.5 BAC 文库构建44
2.2.6 BAC 文库鉴定44-45
2.2.7 同位素原位杂交45
2.2.8 阳性克隆全长测序、组装45-46
3. 实验结果46-53
3.1 半滑舌鳎性别鉴定46-47
3.2 半滑舌鳎基因组大小估计47
3.3 半滑舌鳎 BAC 文库构建47-50
3.4 半滑舌鳎性别相关基因阳性克隆筛选50-53
3.5 BAC 阳性克隆全长测序53
4. 讨论53-55
第三章 性别基因（Cyp19a1a）BAC 阳性克隆浅析55-70
1. 前言55-56
2. 实验材料和策略56-58
2.1 实验材料56
2.2 实验策略56-58
2.2.1 BAC 阳性克隆测序和组装56
2.2.2 数据浅析56-57
2.2.3 荧光定量 PCR 浅析57-58
3. 探讨结果58-67
3.1 Cyp19a1a BAC 阳性克隆序列浅析58-61
3.2 不同鱼类的 Cyp19a1a 基因组结构特点61-66
3.3 半滑舌鳎不同发育时期 Cyp19a1a 的荧光定量浅析66-67
3.4 基因共线性浅析67
4. 讨论67-70
第四章 半滑舌鳎 SNP 高密度图谱构建及性别连锁浅析70-87
0. 前言70-71
1. 材料和策略71-73
1.1 实验材料71
1.2 实验策略71-73
1.2.1 基因组 DNA 提取71
1.2.2 遗传性别鉴定71-72
1.2.3 文库构建及测序72
1.2.4 序列浅析72-73
1.2.5 SNP 图谱构建及连锁浅析73
2. 结果73-85
2.1 DNA 提取及遗传性别鉴定73-74
2.2 亲本全基因组重测序和 F1 子代 RAD-Seq74-78
2.3 SNP 标记基因分型78-79
2.4 高密度遗传连锁图谱构建79-84
2.5 性别连锁浅析84-85
3. 讨论85-87
第五章 半滑舌鳎性逆转的化调控机制87-107
1. 前言87-88
2. 实验材料和策略88-90
2.1 实验材料88
2.2 实验策略88-90
2.2.1 基因组 DNA 的提取88
2.2.2 遗传性别和生理性别鉴定88
2.2.3 MethylC-Seq 文库构建及测序88-89
2.2.4 数据浅析89-90
3. 实验结果90-104
3.1 遗传和生理性别鉴定结果90-91
3.2 半滑舌鳎转移酶91-92
3.3 半滑舌鳎基因组化方式浅析92-97
3.4 半滑舌鳎化基因和非化基因浅析97-101
3.5 差别化浅析101-103
3.6 性别相关基因的化方式103-104
4. 讨论104-107
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